余甘子提取物对非酒精性脂肪性肝病大鼠外周血Treg细胞及肝组织LXRα/FAS通路表达的影响*

胡亦懿，翟英姬，梅迪华，张志侨，罗晓亮，黄燕峰，杜国平

随着肥胖、糖尿病和代谢综合征患病率不断攀升，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)正成为一个新的健康挑战[1,2]。免疫功能失衡参与各种疾病的发生发展，其在NAFLD发病机制中起着重要作用[3,4]。余甘子(PhyllanthusemblicaL.)富含超氧化物歧化酶、维生素C、多酚类和多糖等活性物质，除具有强烈的抗氧化活性外，还具有抗炎症、抗流感、抗高血压、抗肿瘤和护肝等功效[5,6]。本研究采用NAFLD大鼠模型，予以不同剂量的余甘子提取物干预，观察了余甘子提取物对NAFLD大鼠外周血Treg细胞及肝组织LXRα/FAS通路的影响，以期为中医临床治疗NAFLD提供理论依据和新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 48只健康SD大鼠，体质量为180～220 g，购于成都硕达实验动物有限公司【生产许可证号：SCXK(川)2015-030，使用许可证号：SYXK(川)2014-189】。多烯磷脂酰胆碱购于赛诺菲北京制药有限公司(批号：6BJD136)，余甘子提取物购于西安维特生物科技有限公司(含40%多酚)，检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素17(IL-17)、白介素10(IL-10)的ELISA试剂盒购于上海茁彩生物科技有限公司，检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)血生化试剂盒购于上海茁彩生物科技有限公司，抗LXRα购于美国SantCruz公司，抗FAS购于美国Cell Signaling Technology，自动生化分析仪购于日本日立公司，FACSCalibur流式细胞仪购于美国BD公司。

1.2 大鼠NAFLD模型的构建 适应性喂养大鼠1 w，随机将其分为对照组、模型组、多烯磷脂酰胆碱组及小剂量、中等剂量和大剂量余甘子提取物处理组，每组8只。给予造模大鼠高脂饲料喂养连续12 w，给予对照组普通饲料喂养。12 w后，随机取造模组动物3只行肝组织病理学观察。在造模后第2天，分别给予对照组和模型组大鼠0.9% NaCl、多烯磷脂酰胆碱组大鼠多烯磷脂酰胆碱150 mg·kg-1、小、中、大剂量组大鼠余甘子提取物80 mg·kg-1、160 mg·kg-1、400 mg·kg-1灌胃，1次/d，连续给药6 w。 在给药结束后，给予10 %水合氯醛腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血5 mL，其中1 mL加入抗凝管，立即进行后续流式细胞检测；另外4 mL静置后离心分离血清，-80 ℃冰箱保存。迅速摘取肝脏，0.9% NaCl溶液冲洗，滤纸吸干，取肝右叶新鲜组织，一部分经4%多聚甲醛固定，剩余部分置于-80℃超低温冰箱保存，用于后续检测。将固定的肝脏组织按常规方法制备石蜡切片，HE染色，镜检观察。肝脏病变评分参考2010年版《非酒精性脂肪性肝病诊断指南》(修订版)和《美国国立卫生研究院发布的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)临床研究网病理工作组指南》进行评分[7]，评分标准为脂肪变性：<5%记0分，5%～33%记1分，34%～66%记2分，>67%记3分；小叶炎症：无病灶记0分，1～2个病灶/视野(×20)记1分，2～4个病灶/视野(×20)记2分，>4个病灶/视野(×20)记3分；气球样变：无记0分，少记1分，多记2分。

1.3 血清指标检测 采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-17和IL-10水平。

1.4 免疫功能指标检测 取抗凝血1 mL，加入流式测定管，分别加入FITC标记的抗CD4 McAb 5 μL、PE标记的抗IL-17 McAb 5 μL或FITC标记的抗CD4 McAb 5 μL、PE标记的抗CD25 McAb 5 μL混匀，避光孵育约20 min，加溶血素2 mL，避光孵育约10 min，1200 r/m离心5 min，弃上清液，加PBS洗2遍，弃上清液，加入PBS缓冲液，调整细胞数至1×106个细胞/mL，于FACSCalibur 流式细胞仪检测。CD4+IL-17+为Th17细胞，CD4+CD25+为Treg细胞数。

1.5 肝组织LXRα和FAS蛋白表达检测 采用WB法检测肝组织LXRα和FAS蛋白表达，用RIPA裂解液提取肝组织总蛋白，以BCA法行蛋白质定量，并用蛋白上样缓冲液(5×)变性样品，于-20℃保存备用。使用等量蛋白质上样，选择10% SDS-PAGE进行分离，将分离后的蛋白质转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入抗LXRα、抗FAS、抗β-actin，均按1: 500稀释，4℃孵育过夜，TBST清洗。根据一抗来源，选择合适的二抗(稀释比为1: 5000)，室温孵育1 h，TBST清洗，ECL暗室显色。应用Bio-Rad全功能成像系统采集图像，应用Image-ProPlus分析光密度，以β-actin为内参，以阴性对照的目标蛋白相对含量为1，计算各组蛋白质的相对表达量，实验重复3次。

2 结果

2.1各组大鼠肝组织病理学表现 见图1。

2.2 各组大鼠血清细胞因子水平变化的比较 见表1。

2.3 各组大鼠全血CD4+IL-17+和CD4+CD25+Treg细胞百分比比较 模型组血CD4+IL-17+细胞百分比为(1.9±0.4)%，显著高于对照组[(0.3±0.2)%，P<0.05]，而大剂量余甘子处理组血CD4+IL-17+细胞较模型组显著降低(P<0.05，图2A和图2B)；模型组CD4+CD25+Treg细胞百分比较对照组显著降低(P<0.05)，小、中、大剂量余甘子提取物处理组CD4+CD25+Treg细胞显著升高(P<0.05，图2A和图2C)。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现(H&E，400×)a：对照组；b：模型组；c：多烯磷脂酰胆碱处理组；d：小剂量组；e：中剂量组f：大剂量余甘子处理组

表1 各组大鼠血清细胞因子水平比较

与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05

图2 各组大鼠外周血Th17和Treg细胞百分比比较A：各组流式细胞检测表现；B：各组大鼠血Th17细胞数比较；C：各组大鼠血Treg细胞数比较与对照组比，**P<0.01；与模型组比，#P<0.05，##P<0.01

2.4 各组大鼠肝组织LXRα和FAS蛋白表达比较 与对照组比，模型组肝组织LXRα和FAS蛋白相对表达量分别为(1.8±0.1)和(2.0±0.2)，均显著升高(P<0.05)；小、中、大剂量余甘子提取物处理组肝组织LXRα和FAS蛋白表达显著降低(P<0.05，图3)。

图3 各组大鼠肝组织LXRα和FAS蛋白表达强度比较

3 讨论

在我国，许多中药治疗NAFLD的临床疗效显著，其中一些中药已对其分子生物学机制进行了研究【8-11]。余甘子已被证明是具有护肝功效的药物[5]。多烯磷脂酰胆碱胶囊可通过调节NAFLD小鼠模型Treg/Th17细胞和相关的分泌因子平衡，抑制小鼠模型炎症反应，防止脂肪肝的发生发展[12]。本研究组织病理学观察结果显示余甘子提取物可明显改善NAFLD模型大鼠肝组织病理学变化。

研究表明Th17细胞在NAFLD动物模型的肝脏和外周血中大量存在[13，14]。Th17细胞可通过正反馈机制，刺激脂肪细胞、巨噬细胞和单核细胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性因子来参与脂肪组织的炎症[15,16]。Treg细胞特异性转录活化因子为叉头状转录因子3(Foxp3)，发挥免疫调控作用，防止对自身抗原的自身反应性，并在感染诱导的免疫反应中避免效应器T细胞的过度激活和随后的组织损伤[17],肝脏Treg细胞数量减少，Treg细胞与Th17细胞在机体相互拮抗，维持机体免疫炎症平衡[18]。本实验结果显示大剂量余甘子提取物能明显降低血清IL-17和TNF-α，明显增加IL-10水平。余甘子提取物能够调节Treg/Th17细胞比例失调，防止NAFLD大鼠肝脏病变的发生发展[19]。FAS是LXRα的下游基因，能激活FAS的转录，可调控机体脂质代谢[20]。本实验结果显示余甘子可明显降低模型组LXRα和FAS蛋白表达，调节脂质代谢。