促性腺激素释放激素的研究和应用进展

范文静，李纯锦，陈 璐，周 虚

（吉林大学 动物科学学院，长春 130012）

促性腺激素释放激素（GnRH）也叫促黄体化激素释放激素，是一种下丘脑神经肽。垂体分泌的促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）主要受下丘脑十肽GnRH的控制。GnRH在下丘脑神经元中合成，并分泌至垂体门脉循环中，主要作用于垂体前叶。GnRH与G蛋白偶联受体促性腺激素释放激素受体（GnRHR）结合，启动下游信号传导，诱导促性腺激素的产生，FSH和LH进入外周循环，作用于卵巢和睾丸，以调节卵泡生成、排卵、精子和类固醇的生成。GnRH有三种不同形式：GnRH－Ⅰ型、Gn-RH－Ⅱ型和GnRH－Ⅲ型。GnRH最初在20世纪70年代初从哺乳动物下丘脑中被发现。1982年，在非哺乳动物鸡中发现了GnRH亚型，即GnRH－Ⅰ；继GnRH－Ⅰ之后，其他形式的GnRH不断被发现，从鸡下丘脑中分离出GnRH－Ⅱ；在七鳃鳗中发现GnRH－Ⅲ。根据GnRH的不同亚型，在脊椎动物中已鉴定出三个具有相似分布和功能的同源受体，即GnRHR－Ⅰ、GnRHR－Ⅱ和GnRHR－Ⅲ型。但是哺乳动物中仅存在两种类型的GnRHR。GnRHR最早在小鼠垂体促性腺αT3细胞中克隆出来，以后陆续克隆了小鼠、猪、绵羊和牛等动物的GnRHR，这些哺乳动物都被归类为GnRH－Ⅰ型受体，并且受体氨基酸序列具有80%以上的同源性。一些灵长类动物表达Ⅱ型GnRHR，但在人类中不表达功能性Ⅱ型 GnRHR［1］。因 此，GnRHR－Ⅰ型受体是哺乳动物促性腺激素受体表达的主要形式。文章从GnRH和GnRHR分子结构、基因结构、作用机理及GnRH类似物的应用等方面进行简要综述，为更好地应用这一激素提供参考。

1 GnRH结构概述

1.1 GnRH分子结构

GnRH是由下丘脑分泌的十肽，是生殖激素级联的中心调节因子。除章鱼外，所有的GnRH均是由10个氨基酸组成的十肽，且至少有50%的序列相同。哺乳动物的GnRH具有同一化学结构，其结构为pGlu1－His2－Trp3－Ser4－Tyr5－Gly6－Leu7－Arg8－Pro9－Gly10NH2，其分子长度和部分氨基酸序列非常保守［2］。N末端具有环状结构的焦谷氨酸（pGlu）由改性的谷氨酰胺形成；含有氨基的C末端由羧酰胺构成，N端和C端为受体结合和相关的生物活性提供结构支持。GnRH氨基酸序列的第1～4，9，10位较为保守，第6位的甘氨酸保持不变，第5，7，8位氨基酸残基有较大的变异，会发生氨基酸的替换。其中N端的pGlu、His和Trp对于GnRH的生理活性至关重要，而位于第8位的残基则增强了与受体的结合能力。第6位的甘氨酸增加了序列的灵活性，使两个末端彼此靠近，并使其与受体的结合更紧密［3］。在所有的Gn-RH形式中，10个氨基酸残基中的4个位置（位置1，4，9，10）是相同的，所有形式均包含N端焦谷氨酸和C端甘氨酰胺。GnRH－Ⅰ的序列为pGlu1－His2－Trp3－Ser4－Tyr5－Gly6－Leu7－Arg8－Pro9－Gly10NH2，GnRH－Ⅱ的序列为pGlu1－His2－Trp3－Ser4－His5－Gly6－Trp7－Tyr8－Pro9－Gly10NH2，GnRH－Ⅲ的序列为pGlu1－His2－Trp3－Ser4－His5－Asp6－Trp7－Lys8－Pro9－Gly10NH2。将GnRH第6，10位氨基酸加以替换会得到GnRH激动剂；用一个非天然D－氨基酸替代第4，6位氨基酸会得到GnRH颉颃剂。GnRH激动剂与颉颃剂已在动物临床中得到广泛的应用。

1.2 GnRH的基因结构特性

GnRH的每种形式均由其基因编码，编码产物为GnRH的多肽前体。GnRH前体蛋白由一个信号肽、一个GnRH十肽、一个蛋白水解位点（Gly－Lys－Arg）和GnRH相关肽（GAP）组成。GnRH－Ⅰ基因位于人类染色体8p11.2 p21上，带有4个外显子，包含一个276 bp ORF编码92个氨基酸的前体蛋白。第一个外显子未翻译，由下丘脑中表达的61 bp mRNA组成；第二个外显子编码信号序列、GnRH十肽、GKR处理信号和前11个GAP残基；第三个外显子编码32个GAP残基；第四个外显子编码其余的GAP残基，并包含翻译终止密码子以及整个3′UTR［4］。GnRH－Ⅰ基因位于小鼠14号染色体上，该基因调控区域由3个增强子和位于GnRH－Ⅰ转录起始位点上游的启动子组成［5］，小鼠的增强子元件存在mGnRH－Ⅰ基因的－5.5～－2.1 kb之间。研究发现，大鼠和小鼠GnRH基因的第一个外显子分别长145 bp和58 bp。在大鼠GnRH－Ⅰ基因中已鉴定出两个关键区域，包括近端启动子和远端增强子，启动子位于转录起始位点上游173 bp处。GnRH基因在进化上是保守的，在人、大鼠和小鼠之间具有约80%的核苷酸同源性。在软骨鱼鲸鲨，其GnRH－Ⅰ的cDNA序列包含一个71 bp的5′UTR和一个159 bp的3′UTR，具有规范的聚腺苷酸化信号序列（AATAAA），包含一个243 bp的ORF，编码一个81个氨基酸的前体蛋白。而象鲨GnRH－Ⅰ的cDNA序列包含一个486 bp的5′UTR和235 bp的3′UTR，具有规范的聚腺苷酸化信号序列，包含一个252 bp的ORF，编码84个氨基酸的蛋白质［6］。

编码GnRH－Ⅱ的基因定位于人类、黑猩猩20号染色体及牛13号染色体、马22号染色体、恒河猴10号染色体、猪17号染色体。它与GnRH－Ⅰ具有70%的同源性。该基因编码的前体蛋白与其他同工型GnRH的结构方式相同，具有信号肽、Gn-RH十肽、保守的蛋白水解位点和GAP。由于GnRH－Ⅰ中的内含子长，造成编码GnRH－Ⅱ的基因比编码GnRH－Ⅰ的基因短（分别为2.1，5.1 kb）。RNA印迹分析发现，GnRH－ⅡmRNA主要在肾脏、骨髓和前列腺中表达，而GnRH－Ⅰ主要在脑中表达。

2 GnRHR

2.1 GnRHR分子结构

GnRHR属于视紫红质样G蛋白偶联受体（GPCR）家族，是一种糖蛋白，长度为325～328个氨基酸（小鼠和大鼠为327个氨基酸，人为328个），相对分子质量为37 684。GnRHR有G蛋白偶联受体的特点，由7个螺旋跨膜（TM）结构域组成，TM结构域由三个细胞外环（ECL）域和三个细胞内环（ICL）域连接（见图1）。连接跨膜螺旋的胞外结构域和浅表区域通常参与肽激素（如GnRH）的结合。TM结构域与受体的构象变化有关，在信号传导中起重要作用；而细胞内环域与G蛋白和其他蛋白质在细胞内信号转导中的相互作用有关。

目前还不清楚GnRHR的三维结构信息，只能通过对视紫红质G蛋白偶联受体的X－射线扫描和GPCR的序列分析，从分子建模技术中获得信息。所有观察到的变异主要集中于ECL和ICL域。在GnRHR的ECL1中Cys（114）和ECL2中Cys（196）之间存在二硫键，能够预测TM3和TM4的相对位置。TM区域的氨基酸形成潜在的氢键，从而稳定了跨膜结构域。定点诱变研究表明了GnRH及其受体之间的相互作用位点，GnRH与其受体结合的残基位于TM1（Arg1.35）、TM2（Asp2.61／Asn2.65）、TM3（Lys3.32）、TM5（Asn5.39）、TM6（Tyr6.58）和TM7（Asp7.32）［8］。此 外，Trp2.64（101），Lys3.32（121），Asn5.39（212）和Tyr6.58（290）与GnRH的结合过程有关（见图2）。Asp2.61（98）主要与GnRH 的His2相互作用，Asp7.32（302）主要与GnRH的Arg8相互作用，Asp7.32（302）或Arg8的突变导致激素对Gn-RHR的亲和力降低。大多数非哺乳动物GnRHR对GnRH－Ⅱ的亲和力高于GnRH－Ⅰ，但哺乳动物GnRHR对GnRH－Ⅰ的亲和力高于GnRH－Ⅱ。非哺乳动物GnRHR含有Asp2.50／Asp7.49残基，而哺乳动物GnRHR在这些位置上含有Asn2.50／Asp7.49残 基。A.Manilall等［9］利 用Glu2.53（90）和Trp6.48（280）的系统定点诱变，研究了Glu2.53（90）侧链螺旋间的相互作用在GnRH受体生物合成中的作用，结果表明，羧基末端尾巴的所有突变均部分恢复了Glu2.53（90）Ala突变受体的功能，但未恢复其他功能。说明氨基酸取代会严重破坏GnRH受体的生物功能。相比之下，侧链氨基酸长度与Glu（Gln、Leu、Phe和Arg）相同或更长的所有突变都保留了受体功能。然后，A.Manilall等［9］又使用分子模型来识别野生型GnRHR中Glu2.53（90）侧链的螺旋间接触，结果表明，Glu2.53（90）侧链与TM3中的Ser3.35（124）呈螺旋间保守接触，而与TM6中的Trp6.48（280）呈直接接触，但与Lys3.32（121）联系不稳定。而cHH相关的Glu2.53（90）Lys突变体的模型显示与Lys2.53（90）和Ser3.35（124）螺旋间接触不稳定，而Glu2.53（90）Asp突变体显示Asp2.53（90）与Trp6.48（280）没有相互作用。Glu2.53（90）Arg和Trp6.48（280）Arg突变体模型显示了2.53（90）位氨基酸与Ser3.35（124）以及2.53（90）和6.48（280）位残基之间的稳定接触，并增加了TM2－TM6螺旋间的距离。

与非哺乳动物GnRHR不同，哺乳动物GnRHR（即GnRHR－Ⅰ）缺乏典型的胞质内羧基末端尾巴。但在所有其他GPCR家族成员及哺乳和非哺乳动物的GnRH－Ⅱ型受体中都存在这个尾巴，在进化过程中该特征对哺乳动物GnRHR－Ⅰ功能起重要作用。而且细胞内的氨基末端也非常短（只有35个残基），这两个特点造成哺乳类动物的G蛋白偶联受体（GPCR）是最小的。哺乳动物Ⅰ型GnRHR在大鼠、人、绵羊，牛和猪之间具有80%以上的氨基酸同源性。GnRHR－Ⅱ在猴子、猪和狗中发挥全部功能，但在小鼠、绵羊和牛中却不发挥全部功能，在人类和黑猩猩的基因组中则保持沉默。

2.2 GnRHR基因结构

与许多其他无内含子的GPCRs基因相比，GnRHR基因主要功能是编码和控制GnRHR。GnRHR是单拷贝基因，分别位于人的4号染色体上，牛、鼠、羊和猪物种的4，5，6，8号染色体上。对人、小鼠、大鼠和绵羊这些物种的GnRHR－Ⅰ基因结构进行研究发现，该基因在编码区域具有很高的序列同源性［11］。含有三个外显子和两个内含子，根据物种的不同，大小范围为15～31 kb。外显子1编码5′－UTR、跨膜结构域TM1、TM2、TM3和TM4的一部分及ICL1、ICL2和ECL1；外显子2编码TM4的其余部分、TM5结构域、ECL2和ICL3的一部分；外显子3编码TM6、TM7、ECL3和3′－UTR的其余部分（见图3和图4）。尽管人类Gn-RH受体基因的所有外显子－内含子边界的位置在啮齿动物和绵羊序列中都是完全保守的，但人类基因的第一个内含子要小得多。

3 作用机理

3.1 GnRHR的激活

由于G蛋白由α、β和γ亚基组成。Gα蛋白的活化是通过激动剂与GPCR结合而介导的，导致GDP交换Gα亚基上的GTP。G蛋白α亚基与β、γ亚基分离并刺激下游效应因子。因此，GPCR充当G蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子。在某些系统中，β、γ也能够激活效应器系统。效应因子的激活将细胞外信号转化到细胞内，导致Gα－GTP水解为Gα－GDP而关闭信号，又重新与β、γ关联，生成α－GDP－βγ复合物［13］。G蛋白偶联所必需的氨基酸残基在哺乳动物和非哺乳动物GnRHR中均是保守的，这表明不同GnRHR之间受体激活的机制相似。

3.2 GnRHR信号转导机制

在GnRH的刺激下，GnRHR的激活引发了一系列细胞内级联反应。GnRH与GnRHR结合后生成激素受体复合物，通过G q／11激活磷酯酶C（PLC），该酶催化第二信使二酰基甘油（DAG）和肌醇三磷酸（IP3）的产生。产生的IP3能引起细胞内钙的动员，细胞外Ca2＋通过L型电压门控Ca2＋通道流入细胞质中，细胞内Ca2＋增多，从而驱动钙调蛋白及其靶标（包括钙调神经磷酸酶）的激活，促进促性腺激素的释放。DAG与Ca2＋一起激活了多种PKC同工酶，包括αT3－1和LβT2细胞中的常规同工型PKCα、PKCβⅡ，新型同工型PKCδ、PKCε及非典型PKCζ［14］。这些激活的信号与丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）的下游诱导相关。在哺乳动物中已知四种主要的MAPK级联反应：ERK1／2、JNK1－3、p38 和 ERK5。MAPK1／3（ERK1／2）的作用在雌性生殖中是必不可少的。PKC和MAPK1／3激活之间的联系已广为人知（见图5），但Ras／Raf／MAPK激酶（MEKK）信号转导的中间序列并未得到很好的描述。

MAPK1／3激活可通过c－SRC介导的RAS激活发生，在其他细胞中RAS激活通过DAG依赖性GRP1／2发生。但是最近的证据表明，GnRH刺激的MAPK1／3活化取决于NADPH氧化酶产生的活性氧（ROS）［16］。通过Gαq／11发出的GnRH受体信号激活了PLC，产生了DAG和IP3，DAG和IP3诱导的细胞内Ca2＋升高激活了NOX和DUOX家族成员，导致ROS的产生。Ⅰ型VGCC活性氧激活使细胞内Ca2＋增多，支持DUOX的细胞外分泌和激活。ROS通过促进最终靶向MAPK1／3的MEKn级联Ras和Raf激活来刺激MAPK1／3激活。ROS还可通过失活负反馈作用，进而在促进MAP激酶磷酸化激活中发挥重要作用。ROS还可能通过DUSP活性位半胱氨酸的可逆氧化使负反馈暂时失活。通常通过过氧化物酶（PRDX）将活性还原位点的半胱氨酸硫醇C－SH转化为亚硫基C－SOH来还原ROS。通过硫氧还原蛋白（TRX）回收亚磺酰半胱氨酸。过量的ROS导致PRDX过氧化，进一步将亚硫基C－SOH氧化为亚硫基CSOOH，其被SRXN1的ATP依赖的还原酶活性所降低，保留了PRDX的功能，但允许DUSP暂时失活。ROS水平下降后恢复DUSP活性，从而允许MAPK1／3的反馈控制［17］。

J.Lannes等［18］研究了两个靶向同一转录物串联表达的miRNA－132和miRNA－212在GnRH诱导的FSH表达上的作用，证明GnRH 刺激的FSHβ表达取决于miR－132／212，并涉及SIRT1－FOXO1途径。研究表明，GnRH诱导的miR－132和miRNA－212的表达引起SIRT1 mRNA被捕获到RISC中，并随后导致SIRT1脱乙酰基酶含量降低，导致FOXO1的乙酰化增强，从而触发了其从核外的迁移，因此消除了FOXO1对Fshβ启动子激活的抑制作用。随后J.Lannes等［19］证明了miR－125b能够沉默Gαq／11介导的GnRH反应的信号传导，但对Gαs－cAMP激活途径不存在影响，也证明了miR－125b靶向Gαq／11介导途径的几个成分。除了MAP2K7、p38和Jun具有miR－125b的有效靶标外，还发现了其他分子，例如Gαq／11、ITPR1、CaMKⅡa和ELK1。阻断miR－125b会诱导这些靶标的增加，并刺激LH和FSH表达，这表明miR－125b在Gαq／11介导的途径中具有作用。由于其对Gαq／11介导的信号传导的沉默作用，miR－125b可能参与了许多激活该途径的G蛋白偶联受体的调控。

GnRHR还可以激活环状单磷酸腺苷（cAMP）／蛋白激酶A（PKA）／cAMP结合蛋白（CREB）途径（见图6）。在大鼠垂体细胞、LβT2细胞以及包括HeLa、GH3和COS－7细胞在内的许多异源细胞系方面的研究均表明GnRH 刺激cAMP的产生。cAMP产生的刺激独立于Ca2＋；进一步的分析表明，PKCδ和PKCε明显激活了腺苷酸环化酶5（AC5）和腺苷酸环化酶7（AC7），成为GnRH升高cAMP的介质。在大鼠促性腺激素中，促性腺激素亚单位启动子含有CRE，因此cAMP可能通过激活CRE结合蛋白CREB参与促性腺激素的合成。同样，cAMP水平的升高会刺激小鼠、大鼠和人类GSU的转录［20］。将大鼠垂体细胞暴露于能刺激cAMP产生的细胞渗透性类似物中会激活GSU转录，但不会提高LHβmRNA或FSHβmRNA水平。

GnRH诱导的细胞内Ca2＋的快速增加是促性腺激素快速分泌和促性腺激素亚单位基因表达的必要条件。IP3水平升高会激活内质网Ca2＋通道，使Ca2＋释放到细胞质中。在反馈机制中，胞质增多的Ca2＋会抑制IP3激活的Ca2＋通道。然后胞质内增多的Ca2＋又会泵回到内质网，恢复通道并重复该循环。研究表明，GnRH对ERK的激活是通过Ca2＋内流介导的；对JNK激活是由Ca2＋动员介导的；GnRH引起的快速胞吐反应可归因于IP3激活的Ca2＋信号。GnRH 主要需要Ca2＋来升高αGSU和LHβmRNA水平，而FSHβ则需要较少的Ca2＋。Ca2＋在GSU的GnRH刺激中起作用，但在LHβ或FSHβ转录中不起作用。GnRHR诱导的细胞内Ca2＋升高也激活了一氧化氮合酶（NOSⅠ）级联反应，导致cGMP迅速增加。据报道，GnRH可激活钙调蛋白激酶Ⅰ和Ⅱ（CaMKⅠ／CaMKⅡ），而CaMKⅡ抑制作用会导致GSU和LHβ启动子激活降低。另外，CaMKⅠ的GnRH激活通过CaMKⅡa类HDAC的磷酸化介导了FSHβ的抑制，而不是LHβ基因的抑制。CaMKⅡ抑制剂影响K＋通道的电导率，导致细胞去极化和Ca2＋内流。因此，Ca2＋和CaMKⅠ／CaMKⅡ可能发挥反馈机制并参与Gn-RH脉冲频率的解码。

3.3 GnRH受体的脱敏和内化

GPCR的激活通常伴随着脱敏和内化。哺乳动物Ⅰ型受体缺乏一个胞质内C末端尾巴，对于许多GPCRs来说，C末端尾巴在脱敏和转运中起着关键作用。典型GPCR的C末端尾巴在激活后位于受体末端的Ser和Thr残基会被G蛋白受体激酶磷酸化，从而生成抑制蛋白（抑制蛋白2和抑制蛋白3）的对接位点，阻止G蛋白与受体偶联，防止脱敏反应的发生。被磷酸化的Ser和Thr残基通常位于羧基末端的尾巴中。许多研究表明，尾巴缺失的GnRHR既不经历快速的同源脱敏，也不表现出激动剂诱导的受体磷酸化。将各种GPCR的C末端与Ⅰ型哺乳动物GnRHR融合会导致快速脱敏和内化。另外，受体通过网格蛋白包被的囊泡缓慢地内在化，并且该过程独立于β受体而发生。大鼠和人类GnRHR均以网格蛋白依赖性方式内化，并与转铁蛋白共定位，而转铁蛋白通过网格蛋白包被的结构被内化。有研究表明，脱敏作用依赖于miR－125b和miR－132之间的调节环，证明了NSun2是miR－132的靶标，NSun2甲基转移酶依赖PKA的磷酸化导致miR－125b甲基化，并且NSun2可能被PP1α磷酸酶灭活。该调节环倾向于恢复miR－125b和miR－132的稳态水平，取决于PKA 介导的NSun2激活和PP1α引起的失活［19］。在一些神经元和非神经元病理中报道的这两个miRNA的反向动力学可能是该环的失调所致。GPCR脱敏可维持机体的生理平衡，但脱敏过程失调可能会导致多种疾病，如心脏衰竭、哮喘和自体免疫疾病等。

4 GnRH及其类似物的应用

在动物生产繁殖方面，外源性注射GnRH后通过刺激垂体释放LH和FSH，促进类固醇激素合成与释放量的变化。GnRH这个功能用于母畜同期发情，可以使家畜的性成熟期提前，发情期受胎率提高，产后发情时间缩短，家畜超排效果和产仔率提高，治疗母畜卵巢疾病；用于公畜可以提高精液品质，提高瘦肉率，治疗少精、无精症等。研究表明，无论是经产母猪还是初情期前母猪均可以通过使用GnRH及其类似物使母猪的排卵数和产仔数得到不同程度的提高［21］。用GnRH免疫动物，能够抑制动物生殖激素的分泌，抑制被免疫动物生殖器官的发育，表现为性腺萎缩、体积减少和重量减轻。因此，GnRH免疫还被用于雄性动物的免疫去势和雌性动物的避孕及终止妊娠［22］。近年来，Gn-RH类似物大量人工合成并很快应用于临床，Gn-RH激动剂／颉颃剂（如布塞林、曲普瑞林、戈舍瑞林）已被用于治疗生育问题（IVF－ET）或激素依赖性癌症（如卵巢癌，前列腺癌或子宫内膜异位症）［23－25］。GnRH和GnRH激动剂已成功用于诱导青春期，还在IVF－ET治疗中代替或联合hCG治疗［26］。GnRH激动剂（即曲普瑞林）可用于诱导卵巢成熟和卵母细胞的成熟恢复，同时降低卵巢过度刺激综合征（OHSS）的风险［27］。GnRH颉颃剂的重要用途是在妇女的辅助生殖中，GnRH颉颃剂西曲瑞克（Cetrorelix）已被证明对卵巢癌有效。另一种颉颃剂地加瑞克（degarelix）被广泛用于治疗前列腺癌［28］。研究表明，与GnRH激动剂相比，地加瑞克在前列腺癌的治疗中更有效，能够快速抑制睾丸激素水平，同时具有较低毒性，不良反应较少，为前列腺癌患者提供了更好的预后方案［29－30］。现在越来越多的人对GnRH－Ⅱ有了更深入的研究，发现GnRH－Ⅱ和GnRHR－Ⅱ在人类生殖肿瘤中表达，是潜在的新兴癌症治疗靶点。

5 小结

GnRH是哺乳动物生殖功能的主要调控因子，它通过促性腺激素受体上的G蛋白偶联受体，刺激或抑制垂体促性腺激素的分泌，在哺乳动物中发挥着多种调节作用。由于GnRHR在不同细胞中的不同定位以及GnRH在生物体中的多种作用，人们已将GnRH－GnRHR复合物确定为药物开发的靶点，相关的激动剂／颉颃剂已经被开发出来，用于男性和女性不孕症和癌症及动物促进发情、诱导排卵及动物繁殖障碍疾病的治疗。尽管有潜在的副作用，但GnRH类似物已被证明是非常有效的，有助于各种癌症的治疗。随着现代生物学技术的发展和深入研究，对GnRH及其受体结构与调控机理会有更多的认识，GnRH类似物的研究也会不断有新突破，并更好地应用于临床实际中。