纳米材料电化学传感器检测农药残留研究进展

卢 雄，宋丹丹，高发明

(燕山大学 环境与化学工程学院，河北 秦皇岛 066004)

0 引言

我国是一个农业大国，农药作为高毒性的杀虫剂和除草剂，是当前农业生产中不可或缺的物质，在保障农产品产率和产量方面发挥着重要作用。农药的种类有很多，其中有机磷农药以及氨基甲酸酯类农药因其在环境中的半衰期短，对哺乳动物毒性相对较低，且价格低廉等特点，占据了大部分市场[1]。农药有益于农业生产增产丰收，但不合理的过度使用会对环境造成污染，也可能使得农产品中残留的农药超标。残留在农产品以及环境中的农药可导致中毒[2-3]。例如，农药可以与有机体内的乙酰胆碱酯酶特异性结合，抑制其活性，导致乙酰胆碱酯酶对其底物乙酰胆碱水解能力的降低甚至丧失，造成乙酰胆碱在体内的大量累积。而乙酰胆碱是一种神经递质，其大量累积会导致神经传导功能的紊乱，引起一系列的神经中毒症状，甚至导致死亡[4-6]。此外，农药残留问题不仅关系到环境污染与人类的食品安全，其最高残留限量也成为各国农产品贸易间重要的技术壁垒，各国也根据本国国情制定了严格的农药残留限量标准。因此，加强对农药残留的监测，开发一套简便、快速、高灵敏、高精确的农药残留检测分析技术，不仅对于保护生态环境、保障食品安全具有重要意义，而且也可提高我国农产品的安全质量，增强国际竞争力。

传统的农药残留检测方法主要是以色谱技术为主的仪器分析方法，包括气相色谱[7-8]、液相色谱[9]以及高效液相色谱-质谱[10]等多种光谱技术联用的方法[11-12]。这些方法具有灵敏度高、选择性好的特点，能实现对多种农药的同时定性定量检测。但其所需仪器设备操作复杂，检测周期长，可移动性差，不适合现场快速检测[13-17]。电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器则因其所需设备简单便携、成本低、容易操作，并且检测迅速灵敏等优点，能很好地满足农药残留现场实时快速灵敏检测的要求[18-20]。

电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的组装构建，关键在于乙酰胆碱酯酶的固定。作为一类糖蛋白，乙酰胆碱酯酶的活性中心深埋于其蛋白质结构中[21]，这就使得如果直接将酶固定在电极表面，进行检测时，电子在活性中心与电极表面间的传输效率将十分低下，从而影响整个传感器的检测性能。因而，电极修饰材料的应用，对于提升电化学乙酰胆碱酯酶传感器的性能显得至关重要。而纳米材料因其独特的性质成为电化学生物传感器构建中电极修饰材料的重要选择。本文总结了近年来国内外研究人员关于新型纳米材料在电化学乙酰胆碱酯酶传感器检测农药残留方面的研究进展，并对电化学乙酰胆碱酯酶传感器未来的发展趋势进行了展望。

1 电流型乙酰胆碱酯酶传感器

生物传感器是一种以生物活性单元作为识别元件，并结合或紧密连接信号转换元件，从而检测目标分析物的分析检测装置[22-23]。而电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器则是以乙酰胆碱酯酶作为生物识别元件，并通过电极将乙酰胆碱酯酶与分析物发生特异性反应所产生的事件信息转化为电流信号的一种装置。在农药残留分析检测中，由于电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器具有灵敏度高、成本较低、测量方法简单等特点而被人们广泛关注。

电流型乙酰胆碱酯酶(AChE)生物传感器对于农药残留的检测原理是基于农药对于乙酰胆碱酯酶活性的抑制机理。以有机磷农药为例，其与乙酰胆碱酯酶的作用机理如图1所示[20]。有机磷农药可以与乙酰胆碱酯酶活性位点的丝氨酸残基共价结合，形成磷酸化酶，抑制酶的活性，使其催化底物乙酰胆碱的能力降低或丧失。在电化学乙酰胆碱酯酶传感器检测农药的过程中，以氯化乙酰硫代胆碱为底物，乙酰胆碱酯酶可以特异性的催化其水解，生成一种电活性物质氯化硫代胆碱，氯化硫代胆碱可以在电极表面发生氧化，产生一个不可逆的氧化电流。而当农药存在时，它会抑制乙酰胆碱酯酶的活性，从而导致产生的氯化硫代胆碱的量降低，氧化电流减小，从而建立起农药浓度与氧化电流大小变化之间的关系，实现对农药的灵敏检测。

2 纳米材料在电化学乙酰胆碱酯酶传感器中的应用

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1～100 nm)或由它们作为基本单元所构成的材料。在纳米尺寸，材料表现出了与常规材料不同的特性。例如，纳米材料由于其较高的表面能，往往比其块状材料更活跃。同时，纳米材料还具有独特的特性，如高比表面积、高反应活性及催化活性等。由于纳米材料的这些特性，基于纳米材料构建的生物传感器往往能展现出更优异的性能，同时也更易于小型化[24-25]。对于电化学乙酰胆碱酯酶传感器而言，纳米材料不仅起到固定并维持乙酰胆碱酯酶活性的作用，还扮演着电子传输及信号放大的角色。而纳米材料的化学成分、形貌结构、表面质地、结晶度等都影响纳米材料修饰电极的电子传输[25]，故而修饰电极的纳米材料的设计选择显得格外重要。

图1 有机磷农药与乙酰胆碱酯酶的作用示意图
Fig.1 Action of organophosphorus pesticides (OP) on the activity of the AChE

2.1 一维纳米材料在电化学AChE传感器中的应用

一维纳米材料尤其是一维贵金属纳米材料因其具有高的催化活性、良好的生物相容性、长期的稳定性以及优异的导电性而在电化学生物传感领域引起了人们的关注。在电化学乙酰胆碱酯酶传感器检测农药残留方面，Lang等[26]开发了一种基于金纳米棒的电化学乙酰胆碱酯酶传感器，用于农药的检测。由于金纳米棒良好的电催化活性以及生物相容性，该传感器展示出了对于底物氯化硫代乙酰胆碱良好的亲和力，同时促进了作为检测标记物氯化硫代胆碱的电催化氧化，降低了传感器的工作电位。在最佳的工作条件下，该传感器可以实现对于对氧磷与乐果的灵敏检测，检出限分别为0.7 nM以及3.9 nM，检测范围分别为1 nM到5 μM以及5 nM到1 μM。

与单一成分的贵金属一维纳米材料相比，多成分的贵金属材料，有望通过协同效应以及电子效应，进一步提升材料的电化学性能。在此方面，我们成功合成出了具有核壳结构的Pd@Au双金属纳米棒[27]，并将其应用于电化学乙酰胆碱酯酶传感器的构建。该传感器对农药的检测示意图如图2所示。由于Pd@Au双金属纳米棒具有纯净的金壳表面，可以为AChE的固定提供很好的微环境，极大地维持了所固定酶的生物活性，同时，双金属的核壳组成结构，也进一步提高了材料的导电性，使得最终完成的传感器展现出了对于对氧磷优异的检测性能，检出限为3.6 pM，线性范围为3.6 pM～100 nM，灵敏度为7.8 μA/mM。此外，在实际样品检测中，该传感器获得了98.6%～105.2%的回收率，证明了其实用性。

图2 基于Pd@Au双金属纳米棒的电化学AChE传感器对对氧磷的检测示意图
Fig.2 Scheme of the AChE biosensor based on Pd@Au nanorods (NRs) for the detection of paraoxon

相较于纳米棒，高长径比的纳米线则具有更为有效的电子传输途径。高长径比的纳米线还可以在电极表面自组装形成紧密的网状结构，这不仅可以为生物分子的固定提供更多的位点，还可以使生物分子的固定更加牢固。此外，由于纳米线之间的互相连接，其导电性及电催化活性也得到了进一步的提高。基于此，我们制备出了具有高长径比的Pd@Au双金属核壳结构纳米线[28]，其形貌及元素分布如图3所示。利用双金属核壳结构以及高长径比自组装网状结构的双重优势，基于此种材料修饰的玻碳电极获得了更高的电活性面积(0.369 cm2)，约为裸玻碳电极(0.070 7 cm2)的5倍之多。采用此修饰电极所组装的电化学AChE传感器也展现了对于农药马拉硫磷的灵敏分析检测性能，检出限为0.037 pM，线性检测范围为0.1 pM到100 nM。同时，由于该网状结构对于AChE的稳定固定，该传感器还展现出了优异的重复性，5次组间与组内的重复测试，其相对标准偏差分别仅为3.86%与1.78%。

图3 Pd@Au双金属纳米线的形貌及元素分布图
Fig.3 TEM and elemental mapping images of Pd@Au nanowires

在传感器中采用合金纳米线也是一种增加材料组成成分，提升性能的有效手段。通过电子相互作用以及原子排列的变化，合金材料不仅具有更好的导电性与催化活性，还具有良好的化学稳定性且易于功能化。我们基于珊瑚状的Pd-Cu合金纳米线(如图4)成功构建出了可用于灵敏检测农药的电化学AChE传感器[29]。由于该纳米线良好的电化学性能，所构建的传感器展现出了对于马拉硫磷较低的检出限(4.5 pM)以及较宽的线性检测范围(15～3 000 pM，1 500～9 000 nM)。同时，相比于其他合金材料所组装的传感器，基于Pd-Cu合金纳米线的传感器表现出了对于底物优异的亲和力，其米氏常数仅为50.56 μM。表1列举了近年来由一维贵金属纳米材料作为电极修饰材料，所构建的电化学AChE生物传感器的性能比较。

图4 Pd-Cu纳米线的TEM图
Fig.4 TEM images of Pd-Cu nanowires

表1 一维贵金属基电化学AChE传感器检测农药性能比较 Tab.1 Comparison of 1D noble metal based electrochemical AChE biosensor for pesticides detection

2.2 二维纳米材料在电化学AChE传感器中的应用

自2004年英国Konstantin Novoselov和Andre Geim成功剥离出单层石墨烯以来，石墨烯就以其优异的物理化学性能，包括超大的比表面积、优异的导电性以及良好的生物相容性等等，在能源、催化、传感、光电子设备、生物医药等众多领域表现出了巨大的应用价值。在电化学AChE传感器检测农残方面，Zhou等[31]利用羧基化的石墨烯为基底，通过复合SnO2纳米粒子形成复合材料，并以此为基础构建了一种电化学AChE传感器。由于SnO2纳米粒子与羧基化石墨烯之间的协同效应，该复合材料具有优异的导电性、电催化活性以及生物相容性，所构建的传感器可以灵敏检测甲基对硫磷与卡巴呋喃，其检出限分别为0.05 pM和0.5 pM，线性检测范围为0.1 pM到0.1 nM，0.1 nM到10 nM以及1 pM到0.1 nM，0.1 nM到10 nM。Li等[32]通过电化学诱导的方法，成功制备出了一种多孔的氧化石墨烯网状结构，并直接将其应用于电化学AChE传感器的构建。这种多孔的网状结构的氧化石墨烯材料，不仅能有效地促进电子的传输，更有利于底物与酶活性位点的接触，使得最终完成的传感器展现了对于底物氯化硫代乙酰胆碱良好的亲和力，其米氏常数为0.45 mM。在最佳的实验条件下，该传感器对于西维因的检出限为0.75 nM，线性检测范围为1.5～30.3 nM。

除石墨烯外，研究人员还对一些类石墨烯的新型二维纳米材料进行了探索研究，例如过渡金属硫化物、无定形硼化物、过渡金属碳化物或氮化物(MXenes)等。单层或少层的1T相过渡金属二硫属化合物，因其大的表面积、良好的导电性和增强的电催化能力，使其成为众多应用的理想之选。Nasir等[33]采用叔丁基锂剥离技术，成功制备出了一系列的二维1T相过渡金属二硫属化合物，包括MoS2、MoSe2、WS2、WSe2，并将其全部应用于电化学AChE传感器的构建，用以检测农药残留。图5为传感器的组装及检测示意图。研究结果表明，由于这些材料所具备的优异性能，四种材料所构建的传感平台都实现了对于检测信号的放大作用，并且WS2的性能最佳。最终采用1T相WS2构建的传感器对于杀螟硫磷的检出限为2.86 nM，检测范围为1～1 000 nM，并且具有良好的线性(r=0.987)。

图5 基于1T相过渡金属二硫属化合物的AChE传感器的组装及检测示意图
Fig.5 Illustration on the construction of the proposed pesticide biosensor

除了较难获得的1T相的过渡金属二硫属化合物外，通常的2H相的过渡金属二硫属化合物，如MoS2，因其自身的高比表面积，良好的生物相容性，易于功能化，较好的电化学催化活性以及敏感的表面状态等，使得MoS2在电化学生物传感领域表现出了巨大的潜力。但由于MoS2纳米片的导电性相对较差，限制了其直接在电化学传感平台构建中的应用。我们通过对单层MoS2纳米片进行修饰，向其中引入Pd-Ni双金属合金纳米线[34]，一方面Pd-Ni双金属合金纳米线提升了MoS2纳米片的电化学性能，同时，MoS2纳米片作为支撑材料，扩大了材料的活性表面积。利用该复合材料组装电化学AChE传感器检测氧乐果的示意图如图6所示。由于两种材料间的协同效应，所组装的传感器展现出了对于农药良好的检测性能，对于氧乐果的检出限为0.05 pM，检出范围为0.1 pM～100 nM。

图6 构建AChE-Chit/PdNi NWs/m-MoS2/GCE传感器检测氧乐果的原理示意图
Fig.6 Illustration of the fabrication process of AChE biosensor for omethoate assay

此外，我们还通过元素掺杂的方式，对MoS2纳米片进行改性。通过向MoS2纳米片中同时掺杂氮、氟两种非金属元素，改善了MoS2纳米片的导电性，丰富了其表面活性位点，从而优化了MoS2纳米片的电学性能。最后，采用原位生长的方法，制备出了Ag纳米粒子与N-F-MoS2纳米片的纳米复合材料[35]。与未掺杂或未复合的MoS2纳米片相比，该复合材料表现出了更快的电子传递速率，增多的反应活性位点，增大的电活性表面积和优越的导电性。使用该复合材料构建的电化学AChE传感器分别检测久效磷和毒死蜱(示意图如图7所示)，得到的检出限分别为0.2 pM和2.9 pM，检出范围分别为0.4 pM到4 nM和0.14 nM到0.29 nM，0.29 nM到0.29 μM。

作为一类二维层状材料，过渡金属碳化物或氮化物(MXenes)因其卓越的物理和化学性能而受到广泛关注。由于MXenes纳米片具有类似金属的特性，因而具有出色的导电性，同时，它还具有亲水性表面，使其易于在水中分散。这些特性使得MXenes纳米片在生物传感领域引起了越来越多的关注。Jiang等[36]采用了一种被广泛研究的MXenes材料，Ti3C2Tx纳米片作为基底材料，通过原位还原的方法，制备了一种Ag@Ti3C2Tx的复合材料。Ag纳米粒子的引入，提升了Ti3C2Tx纳米片的导电性与生物相容性，同时，Ti3C2Tx纳米片的存在也防止了Ag纳米粒子的团聚。通过Ag纳米粒子与Ti3C2Tx纳米片之间的协同效应，该Ag@Ti3C2Tx复合材料不仅具有更好的导电性，同时也更适合AChE的固定，并维持其活性。使用该复合材料固定AChE组装电化学生物传感器并检测农药的示意图如图8所示。最终获得的传感器实现了对马拉硫磷的超灵敏检测，检出限为3.27×10-15M，检测范围为10-14～10-8M。

图7 AChE/CNTs-NH2/Ag NPs-N-F-MoS2/GCE检测久效磷和毒死蜱的示意图
Fig.7 The fabrication process of the AChE/CNTs-NH2/Ag NPs-N-F-MoS2/GCE for detection of monocrotophos and chlorpyrifos

图8 基于Ag@Ti3C2Tx组装电化学AChE传感器及农药检测的示意图
Fig.8 Schematic illustration of the fabrication process of the AChE biosensor based on Ag@Ti3C2Txfor determination of malathion

由于其独特的短程有序和长程无序的原子排列以及高浓度的配位不饱和位点和可调节的元素成分，无定形金属硼化物引起了科研工作者们越来越多的关注[37-38]。同时，结合其固有的导电性，化学和热稳定性以及低成本和易于制备等特点，无定形金属硼化物在催化剂、燃料电池以及超级电容器等领域都获得了广泛应用[39-41]。我们利用无定形金属硼化物中因大量未配位的金属原子而拥有的丰富的缺陷位点，用以固定AChE，探究了无定形金属硼化物在电化学生物传感领域的应用[42]。以无定形钴镍硼化物为代表物，研究了组成成分以及结晶度对材料电化学性能的影响，确定了最佳的样品为Co-2Ni-B化合物。

图9为其透射电镜图片以及X射线衍射图谱，从中可以看出该化合物是由无定形的纳米片状结构无规则的堆叠而成。由于无定形Co-2Ni-B化合物表面丰富的缺陷位点所带来的高反应活性，以及双金属协同效应导致的优良导电性，最终组装的传感器实现了对毒死蜱的灵敏检测，检出限为3 pM，检出范围为3 pM～300 nM，为灵敏电化学生物传感平台的构建引入了一类新的有前景的材料。多种基于二维纳米材料的电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器用于农药检测的相关检测性能如表2所示。

图9 样品Co-2Ni-B的透射电子显微镜图以及X射线衍射图谱
Fig.9 TEM image and XRD pattern of Co-2Ni-B

表2 基于二维纳米材料的电化学AChE传感器检测农药性能比较 Tab.2 Comparison of 2D nanomaterials based electrochemical AChE biosensor for pesticides detection

2.3 三维纳米材料在电化学AChE传感器中的应用

三维纳米结构材料由于具有大的比表面积、优异的电子传输能力、良好的力学性能以及稳定的多孔结构而受到广泛关注。尤其是三维碳材料，将一些其它纳米材料如金属纳米粒子或金属氧化物负载于三维碳材料的多孔结构，不仅可以增大电活性物质的比表面积，还可以提高其电化学稳定性，因此三维碳材料被认为是理想的电化学传感和催化剂载体材料之一。Bao等[43]合成了一种具有花状结构的氧化铜纳米材料，并将其负载于三维石墨烯上形成复合材料(形貌如图10所示)，再以此为基础开发了一种用于农残检测的电化学AChE传感器。与典型的单层石墨烯相比，由于其多孔的网状结构，三维石墨烯具有较高的孔隙率与疏水性。此外，它还具有较高的比表面积以及丰富的活性位点，这些都将为AChE的负载提供一个良好的微环境。另一方面，氧化铜纳米花显示出了对于巯基化合物良好的亲和力，这将有利于底物氯化乙酰硫代胆碱在电极表面的富集，从而提高传感器的灵敏度。在三维石墨烯以及花状氧化铜纳米材料的协同作用下，该传感器展现了对于马拉硫磷的灵敏检测，检出限为0.92 pM，检测范围为3 pM～46.665 nM。

图10 三维石墨烯、氧化铜纳米花及其复合材料的SEM图
Fig.10 SEM images of 3DG, CuO NFs and their composites

Dong等[44]同样采用三维石墨烯作为衬底，通过化学镀的方法，在其上覆盖了一层金纳米粒子，并基于此复合材料构建了一种电化学AChE传感器，其酶电极的组装示意图如图11所示。与共价自组装的方法合成的金纳米粒子相比，采用此方法制备的金纳米粒子分布更加均匀，故而具有更好的电化学性质。结合三维石墨烯固有的大的比表面积，该复合材料不仅为AChE的负载提供了有利的条件，同时还可实现对检测信号增强放大的作用，从而综合提高了传感器的检测性能。在最佳的实验条件下，该传感器对于马拉硫磷的检出限为0.084 pM，检测范围为0.3 pM～3 nM。对于甲基对硫磷的检出限为0.082 4 pM，检测范围为0.38 pM～3.8 nM。

图11 乙酰胆碱酯酶电极的组装示意图
Fig.11 Schematic representation of the construction of the enzyme electrode

除了三维碳材料外，Peng等[45]合成了一种由NiCo2S4纳米棒组装而成的网状空心球结构纳米材料(如图12所示)，并将其作为AChE的固定基质，组建了一种电化学AChE传感器。由于NiCo2S4较低的带隙，故而具有良好的导电性，可以有效地促进电活性物质氯化硫代胆碱的电催化氧化。同时，网状空心球结构也为AChE的负载提供了大的表面积以及丰富的活性位点。这些性质特点都增强了传感器的电化学响应，从而提高了传感器的检测性能。以甲基对硫磷与对氧磷为例，该传感器对两种农药的检出限分别为1.6 pM与0.13 pM，检测范围分别为3.8 pM～38 nM与0.36 pM～0.36 nM。

图12 NiCo2S4的SEM以及TEM图
Fig.12 SEM image and TEM image of NiCo2S4

对于三维材料在电化学AChE传感器应用方面，我们也开展了研究[46]。通过将Mn-MOF煅烧，制备出了一种由纳米片垂直有序堆叠而成的三维立方体结构的MnO2/Mn3O4复合材料，解决了单层或少层片状纳米材料在修饰电极时容易聚集的缺点，实现了层状结构的长期稳定性，同时也展现出了良好的电化学性质。随后，通过将MXene/Au NPs复合材料与该立方体材料复合，进一步提升了材料的比表面积与导电性，并最终用于固定AChE，完成传感器的构建。材料的制备以及传感器的组装过程示意图如图13所示。

图13 纳米复合材料的制备及传感器的组装过程示意图
Fig.13 Illustration of the formation of the nanocomposites and fabrication process of biosensor

由于该复合材料对检测信号的协同放大效应，该传感器表现出了优异的性能，对于甲胺磷的检出限为0.13 pM，检出范围为1 pM～1 μM。采用不同三维纳米材料构建的电化学农残检测生物传感器性能比较见表3。

表3 三维纳米材料构建的电化学AChE传感器检测农药性能比较 Tab.3 Comparison of 3D nanomaterials based electrochemical AChE biosensor for pesticides detection

3 总结与展望

鉴于农药对于人类健康及国际农产品贸易的影响，加强对环境以及食品、农产品中的农药残留监测就显得十分重要。本文首先简要介绍了电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器用于农药残留检测的机理，由于酶的高选择性和特异性，由AChE作为生物识别元件构建的生物传感器因其优异的特性而在农药残留检测方面受到关注。在电化学AChE生物传感器的构建中，纳米材料作为一种出色的电极修饰材料以及酶固定基质，可以有效地提升传感器的性能。随着纳米技术的发展，作为电极修饰材料及固定基质的更多更可靠、更高效的新型功能化纳米材料的出现，将会促进低成本、更复杂的多分析物传感检测技术的开发。

然而，由于酶的热稳定性以及化学稳定性较差，不能实现较宽范围的pH值和温度值下的检测，因此除了作为电极修饰材料的纳米材料的开发利用以外，还应着重关注功能化类酶纳米材料的开发。这种类酶的仿生纳米材料不仅具有酶的特性用以检测农药残留，还能克服生物酶本身环境耐受性差的缺点，使得利用仿生纳米材料所构建的传感器在保留优异的检测性能以外，其适用性以及使用寿命，都会得到很大的提高。

除此之外，面对日益严格的农药残留限量标准以及各种不同的检测要求，未来用于农药残留检测的电化学传感设备，应同时具备一步检测、多重检测以及便携式移动检测的功能，以更好地满足社会以及市场的需要。这就要求除了对生物识别元件进行改进以外，还应积极开发基于芯片以及纸基平台等新的传感技术，以进一步减少测定步骤并实现设备的小型化。随着固定矩阵和微电子技术的发展，将对此部分提供有效的支撑。只有生物(仿生)识别元素、新型纳米材料以及信号转换器的协同发展，才能获得能适应未来各种不同需求的用于农药残留检测的生物传感器。