慢性心力衰竭患者血清miR-21、TIMP3 表达及其与心肌重构和心功能的相关性

陈旭杰，罗 明

（南阳市第二人民医院1 心血管内科；2 妇产科，河南 473000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各种心脏疾病的最终结局[1]，临床主要表现为呼吸困难和体液潴留，5 年存活率与恶性肿瘤相仿[2]。有研究表明，miR-21 参与心肌梗死、冠心病等多种心血管疾病发生过程[3]。组织基质金属蛋白酶抑制剂-3（tissue matrix metalloproteinase inhibitors，TIMP3）是miR-21 靶基因之一，可导致心肌纤维化[4]。本研究选取 2016 年 4 月—2018 年 6 月我科收治的 114 例CHF 患者，探讨血清miR-21、TIMP3 表达情况及其与心肌重构和心功能的相关性，为临床评估CHF 提供参考指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 CHF 患者114 例，其中男性54 例，女性 60 例；年龄 38～67 岁，平均 52.38±6.29 岁；按《慢性心力衰竭诊断治疗指南》[5]进行心功能分级：Ⅰ～Ⅱ级35 例、Ⅲ级40 例、Ⅳ级39 例。纳入标准：（1）符合《慢性心力衰竭诊断治疗指南》关于CHF 诊断标准，并经心电图、超声心动图、胸部X 线检查确诊；（2）心脏病史 6 个月以上。排除标准：（1）合并肝、肾等多器官衰竭者；（2）入院前30 天内接受介入术治疗者；（3）伴有心脏瓣膜病、肺动脉栓塞者。另取同期健康体检正常者40 例为对照组。所有研究对象签署参加本研究的知情同意书。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-21、TIMP3 mRNA 检测：抽取研究对象早晨空腹静脉血5 mL，-4 ℃冷冻离心10 min，分离血清，-80 ℃保存待测。采用qRT-PCR 法测定血清miR-21、TIMP3 mRNA 相对表达量。按Trizol试剂盒说明书操作提取组织总RNA，按miRNA 反转录试剂盒操作步骤将2 μg RNA 反转录为cDNA，按SYBR Green RCR master mix 试剂说明配置反应体系。qRT-PCR 反应体系 20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，ddH2O 6.0 μL。在荧光定量PCR 仪上进行反应，程序设定：95 ℃预变性 4 min；95 ℃ 15 s ，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共 41个循环，72 ℃终延伸 10 min。miR-21 以 U6 为内参基因，TIMP3 mRNA 以β-actin 为内参基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物设计见表1。每个样品设置3 个平行，对所得数据Ct 值进行分析，采用 2-ΔΔCt算法[7]计算 miR-21 和 TIMP3 mRNA 相对表达量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.2 超声心动图检测：检测左室舒张末内径（LVEDD）、左心房内径（LAD）、左心室后壁厚度（LVPW）、左室质量指数（LVMI）、左室重构指数（LVRI），利用二维上平面法检测反映心功能的心输出量（CO）和左室射血分数（LVEF）。

1.2.3 血清N-末端脑钠肽前体（NT-proBNP）检测：采用武汉明德生物科技有限责任公司试剂盒，免疫层析法检测血清心衰标志物NT-proBNP 水平。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以表示，多组间比较行方差分析，两组间比较采用t 检验，采用Pearson 法进行相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-126 及 TIMP3 表达水平比较 各组间miR-126 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；CHF 患者miR-126 表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CHF 心功能各级患者miR-126 表达高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；随着心功能分级的提高，miR-126 表达逐渐增加，其中Ⅳ级患者高于Ⅲ级患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组间 TIMP3 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。CHF 患者 TIMP3 表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CHF 心功能各级患者TIMP3 表达低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），且Ⅳ级＜Ⅲ级＜Ⅰ～Ⅱ级，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组miR-126 及TIMP3 表达情况

2.2 心肌重构、 心功能及心衰标志物水平比较 与对照组比较，CHF 各级心功能组LVPW、LVMI 升高，CO、LVER、NT-proBNP 降低，Ⅲ级、Ⅳ级LVEDD、LAD 升高，LVRI 降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；CHF 组 LVEDD、LAD、LVPW、LVMI、NT-proBNP 随心功能分级升高而升高，LVRI、CO、LVER 随心功能分级降低而降低。见表3。

2.3 血清miR-21 与TIMP3 表达相关性 Pearson相关分析显示，miR-21 与 TIMP3 呈负相关（r＝-0.719，P＝0.006）。

2.4 血清miR-21、TIMP3 表达与心肌重构、心功能及心衰标志物相关性 miR-21 与LVEDD、LVPW、NT-proBNP 呈显著正相关（r＝0.624，0.593，0.671，P＜0.05），与 LAD 呈一般正相关（r＝0.476，P＜0.05），与LVMI 无明显相关性（r＝0.193，P＞0.05），与 LVRI、CO、LVER 呈显著负相关（r＝-0.624，-0.509，-0.602，P＜0.05）。TIMP3 与 LVEDD、LVMI 呈显著负相关（r＝-0.537，-0.596，P＜0.05），与 LVPW 呈一般负相关（r＝-0.436，P＜0.05），与 LVRI、LVER、NT-proBNP 呈显著正相关（r＝0.613，0.674，0.693，P＜0.05），与 LAD、CO 无显著相关性（r＝-0.264，0.126，P＞0.05）。见表 4。

表4 miR-21、TIMP3 与心肌重构、心功能及心衰标志物相关性分析

3 讨 论

CHF 常伴随呼吸困难、咳嗽、大咯血等症状[6-8]，其病理机制非常复杂，研究表明心肌重构在其中发挥重要作用[9]。研究发现，通过药物增加TIMP3 蛋白表达对心室重构的改善有一定作用[10]，CHF 患者血清miR-21 显著增加[11]。miRNA 参与多种疾病的发生发展进程，其异常表达与疾病诊断、分期、预后密切相关，研究miRNA 与心肌重构的关系具有广阔前景[12]。miR-21 是心肌细胞分化重要调节因子，在心肌肥厚中研究已有多年历史，但其表达存在争议。张一思等[13]发现，miR-21 在小鼠心脏病模型的成纤维细胞中表达上调，但刘振等研究结果相反，在心衰心肌组织中miR-21 表达下调。miR-21 通过下调其靶基因Spry2，使心肌细胞间产生特异性丝状连接。本研究结果显示，CHF 患者血清miR-21 表达水平显著高于正常组，提示miR-21 可能与CHF 发生有关。NT-proBNP 是重要心衰标志物，可反映左室舒张功能和瓣膜功能障碍。Pearson 分析显示，血清miR-21与 LVEDD、LVPW、NT-proBNP 呈显著正相关，与LAD 呈一般正相关，与 LVRI、CO、LVER 呈显著负相关，进一步说明血清miR-21 表达水平与心室重构、心衰标志物密切相关。

近年发现，TIMP3 编码组织金属蛋白酶抑制物3 蛋白质，钙蛋白可抑制组织中基质金属蛋白酶（MMPs），MMPs/TIMP 失衡可导致心室肌间质纤维化，心室肌间质纤维化是由于组织外胶原过度堆积，导致心室变硬，进而影响心脏收缩舒张功能，纤维化程度随时间而加重[12]。心肌纤维化影响Na+、K+离子通道，导致细胞间电交联异常，同时细胞严重缺氧。因此，心室肌间质纤维化影响心肌代谢与性能，最终影响心室功能。压力负荷可使MMPs 升高，正常胶原被MMPs 降解，并被缺乏连接结构的纤维性结构取代，从而室壁变薄，心室扩张，心功能下降。张一思等[13]研究表明，基质金属蛋白酶表达升高及其抑制物-1 表达下降参与心肌重构的病理过程，是影响心衰患者心功能的重要因素之一。Dai 等[14]通过抑制miR-21 表达，上调TIMP3 表达来抑制心力衰竭，表明miR-21 可通过调控TIMP3，使 MMPs/TIMPs 失衡，造成心肌重构。Villa 等[15]敲除小鼠TIMP3 基因，导致心肌胶原含量下降，左心室几何形状发生改变，造成心肌重构。本研究结果显示，与体检健康者相比，CHF 患者血清TIMP3 表达量降低，提示TIMP3可能参与CHF 的发生进展进程。相关性分析显示，TIMP3 与 LVEDD、LVMI 呈显著负相关，与 LVPW 呈一般负相关，与 LVRI、LVER、NT-proBNP 呈显著正相关，与LAD、CO 无显著相关性，进一步说明血清TIMP3 表达水平与心室重构、心衰标志物密切相关。miR-21 与 TIMP3 呈负相关，揭示 miR-21 可能通过负调控TIMP3 表达，致使MMPs/TIMPs 失衡，参与心肌重构过程。

综上所述，CHF 患者血清 miR-21 高表达，TIMP3 低表达，与心肌重构和心功能密切相关。关于miR-21 及TIMP3 在CHF 病理过程中的具体分子机制有待进一步研究。