UPLC-Q-TOF-MS 法分析芪风固表颗粒化学成分

郑单单 魏文峰 霍金海 王伟明

（黑龙江省中医药科学院， 黑龙江 哈尔滨150036）

芪风固表颗粒由黄芪、防风、炒白术、刺五加、麦冬、五味子6 味中药组成，具有益肺、健脾、补肾的功效，又能益卫固表、补气生津，是治疗表虚不固易感病症有效药物。文献报道表明，芪风固表颗粒能止咳化痰，延长咳嗽潜伏期，又能缓解气管炎症，抑制肺组织病变，改善和治疗支气管炎和肺炎，减少肺部炎症发作，能调节免疫功能使机体免疫系统恢复到平衡状态［1-4］。芪风固表颗粒现有的质量检测标准［WS-5389（13-0389） -2］，包括对方中异嗪皮啶、五味子醇甲2 种成分及白术、防风、麦冬3 种药材的薄层鉴别，以及对其单一成分黄芪甲苷的HPLC 含有量测定。但是芪风固表颗粒的成分复杂，单一成分的含有量测定相对片面；同时芪风固表颗粒化学物质组尚不明确，药效物质基础无从溯源，无法确定质量标准提升的指标性成分，制约了其质量标准提升研究。

中药及中药复方中化学物质种类繁多，结构复杂，LC-MS联用技术集HPLC 的高分离效能和质谱的高选择性、高灵敏度为一体，可以快速分析推断中药及中药复方中的化学成分［5-9］。本实验采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS） 技术分析推断芪风固表颗粒中的化学成分，以期为药效物质基础提供溯源依据，从而为芪风固表颗粒的质量标准提升研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Waters ACQUITYTMUPLC 色谱仪（美国Waters公司）；AB SCIEX Triple-TOFTM 5600 ＋质谱仪（美国AB SCIEX 公 司）；ST16R型低温高速离心机（美 国Thermofisher Scientific 公司）；BSA224S-CW型、BP211D型电子天平（德国Sartorius 公司）；KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂 甲醇、乙腈（均为色谱纯，德国Merck 公司）；甲酸（色谱纯，美国Fisher 公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

1.3 药材与对照品 黄芪（批号20180909）、防风（批号DC1111）、麸炒白术（批号 180602）、麦 冬（批号180501）、五味子（批号 20180325）、刺五加（批号20171121） 饮片均购于北京同仁堂（亳州） 饮片有限责任公司。刺五加按2015 年版《中国药典》 方法制成刺五加浸膏。5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号J-002-170731）、五味子醇甲（批号W-002-181222）、佛手柑内酯（批号F-008-181106）、绿原酸（批号L-007-160504） 对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度＞98%）。

2 方法

2.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Van Guard Pre-Column 预柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；流动相0.1% 甲酸水（A） -0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序（0～15 min，95%～50% A；15～18 min，50%～0 A；18～18.1 min，0～95% A；18.1～20 min，95% A）；柱温35℃；体积流量0.3 mL／min；样品仓温度4℃；分析时间20 min；进样量5 μL；色谱仪流出液不分流直接进行正负离子扫描检测。

2.2 质谱条件 电喷雾正、负离子模式；正／负离子源电压分别为5 500 V／-4 500 V；离子源温度550℃；雾化气体N2，雾化气、辅助气压力均为379.2 kPa；气帘气压力为241.3 kPa；裂解电压为±80 V，碰撞能量为±35 eV，碰撞能量扩展均为15 eV。TOF MS 扫描范围为100～1 500 Da，IDA 设置响应值超过100 cps 的8个最高峰进行二级质谱扫描，Product Ion 扫描范围为50～1 500 Da，开启动态背景扣除（DBS）。数据采集所用软件为Analyst TF 1.6 software，数据处理软件为Peakview 2.0。

2.3 供试品溶液制备 按照《国家药品监督管理局标准（执行） 》 WS-5389（B-0389） -2（《标准》 ） 规定，芪风固表颗粒取黄芪3 000 g、白术（炒） 1 000 g、五味子500 g、防风1 000 g、麦冬1 000 g，煎煮2 次，每次1 h，合并煎液，离心，滤过，静置24 h 后取上清液，加入刺五加浸膏75 g，浓缩至相对密度1.20～1.22（60℃） 的清膏，趁热加入糊精适量，混匀，60℃干燥，粉碎成细粉，加乙醇适量制粒，干燥。按《标准》 的1／20 用药量以上述方法，制备芪风固表颗粒供试品溶液。取供试品芪风固表颗粒粉末约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇30 mL，密塞，称定质量，超声处理50 min，放冷至室温，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，5 000 r／min 离心10 min，取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.4 单味药及阴性样品溶液制备 按“2.3” 项下《标准》 的1／20 用药量及制备方法，制备黄芪、防风、白术、麦冬、刺五加、五味子单味样品，以及缺这6 味药的阴性样品。分别取以上6 味药单味药样品粉末约3 g，按“2.3”项下方法制备相应溶液；分别取以上阴性样品粉末约3 g，按“2.3” 项下方法制备相应阴性样品溶液。

2.5 数据分析 查阅国内外相关文献资料［10-18］，整理芪风固表颗粒组方中6 味药所含的化学成分信息，建立化学成分数据库，将所有化合物分子式导入Peakview 2.0，对样本数据进行筛查。UPLC-Q-TOF-MS 获得色谱峰的同位素丰度及一级、二级质谱，利用Peakview 2.0 软件中的Formula Finder 计算出的高分辨精确分子质量，快速推测各色谱峰对应化合物的分子式，并与部分对照品的保留时间及二级质谱数据对比，确认推断成分。对于一些无法获得对照品的化合物，先依据MS／MS 碎片信息计算出每一个二级碎片的元素组成，再推测其裂解方式，解析化合物结构。

3 结果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS 成分推断 在“2.1” “2.2” 项条件下分析样品，正负离子扫描模式下各成分的分离度及离子化程度均较好，总离子流图见图1。

图1 芪风固表颗粒总离子流图

3.2 成分分析 共分析和推断出110个化合物，比对单味药及阴性对照样品，其中22个来自黄芪，21个来自五味子，14个来自刺五加，13个来自防风，10个来自麦冬，6个来自白术；另有1个为黄芪和白术共有，4 种成分为黄芪和刺五加共有，2 种成分为黄芪和五味子共有，3 种成分为刺五加和五味子共有，2 种成分为麦冬和刺五加共有，1 种成分为防风和白术共有，1 种成分为防风和刺五加共有，1种成分为白术和刺五加共有，1 种成分为白术、防风、刺五加共有，4 种成分为黄芪、刺五加、五味子共有，1 种成分为黄芪、麦冬、防风共有，1 种成分为麦冬、刺五加、五味子共有，1 种成分为五味子、白术、麦冬、刺五加共有，1种成分为刺五加、黄芪、五味子、防风共有。具体见表1。

3.3 质谱分析

3.3.1 黄酮类 黄芪的化学成分主要为黄酮类，另外防风中色原酮类成分及麦冬中的高异黄酮类也属于黄酮类。其主要成分之一为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，该化合物为黄酮类的葡萄糖苷，在正离子模式下，准分子离子峰m／z447.129 0［M＋H］＋失去一个脱水葡萄糖中性离子，得到基峰碎片离子m／z285.07 50［M＋H-C6H10O5］＋，基峰碎片离子脱掉一个CH3，产生碎片离子m／z270.051 3［M ＋HC6H10O5-CH3］＋，随后脱去一个OH，产生碎片离子m／z253.048 5［M＋H-C6H10O5-CH3-OH］＋，该碎片离子C 环失去一个CO，产生碎片离子m／z225.053 4［M＋H-C6H10O5-CH3-OH-CO］＋，参考文献［19］中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的碎片离子（m／z），对照该化合物二级质谱图，见图2，该化合物可推测为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，根据黄酮类成分的裂解规律进行推测，见图3。

图2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷正离子模式下二级质谱图

图3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷裂解途径

5-O-甲基维斯阿米醇苷是防风中的色原酮类成分之一，以5-O-甲基维斯阿米醇苷为例推测防风中色原酮类成分的裂解途经，正离子模式下，其准分子离子峰m／z453.172 7［M＋H］＋，脱去脱水葡萄糖中性离子，得到基峰碎片离子m／z291.120 5［M＋H-C6H10O5］＋，基峰碎片离子脱去一个中性离子H2O，产生碎片m／z273.109 8［M＋H-C6H10O5-H2O］＋，继而丢失一个丙烯中性离子C3H6，产生碎片离子m／z231.062 5［M＋H-C6H10O5-H2OC3H6］＋，随后C 环断裂失去一个CO，产生碎片离子m／z203.067 8［M＋H-C6H10O5-H2O-C3H6-CO］＋，对比5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的二级质谱图，见图4，参考文献［20］，该化合物可推断为5-O-甲基维斯阿米醇苷，裂解途径见图5。

3.3.2 木脂素类 五味子的主要成分是木脂素类，以五味子醇甲为例，正离子模式下，其准分子离子峰m／z433.201 2［M ＋H］＋，失去一个中性离子H2O，得到碎片离子m／z415.210 7［M＋H-H2O］＋，该碎片有2 种裂解方式，一种可能失去一个CH3，产生碎片离子m／z400.187 1［M＋H-H2OCH3］＋，该碎片离子八元环断裂失去C4H6形成六元环，产生碎片离子m／z346.141 6［M＋H-H2O-CH3-C4H6］＋，另一种可能发生如下裂解，C5位失去OCH3，得到特征碎片离子m／z384.192 7［M＋H-H2O-OCH3］＋，该碎片离子又有2种裂解方式，一种是C5′位再失去一个OCH3，C5位和C5′位成键得到碎片离子m／z353.173 1［M＋H-H2O-2OCH3］＋，另一种是C5′位失去CH3，C5′位连接的O 和C5位成键，产生碎片离子m／z369.169 9［M＋H-H2O-OCH3-CH3］＋，该碎片离子又失去C4’位OCH3，产生碎片离子m／z338.150 8［M＋H-H2O-2OCH3-CH3］＋，结合文献［21］所述裂解途径，对比五味子醇甲对照品的二级质谱图，见图6，该化合物可推断为五味子醇甲，参考木脂素类化合物的裂解规律进行推测，见图7。

图4 5-O-甲基维斯阿米醇苷正离子模式下二级质谱图

图5 5-O-甲基维斯阿米醇苷裂解途径

图6 五味子醇甲正离子模式下二级质谱图

3.3.3 香豆素类 香豆素类主要来自防风，以佛手柑内酯为例，正离子模式下，其准分子离子峰m／z217.049 8［M＋H］＋，脱去一个CH3，得到碎片离子m／z202.025 7［M＋H-CH3］＋，随后该碎片离子内酯环失去一个CO 重新成环，产生基峰碎片离子m／z174.030 7［M＋H-CH3-CO］＋，该碎片离子又失去一个CO，产生碎片离子m／z146.035［M＋H-CH3-2CO］＋，参考文献［22］，对比佛手柑内酯对照品的二级质谱图，见图8，确认该化合物为佛手柑内酯，参考香豆素类化合物的裂解规律进行推测，见图9。

3.3.4 有机酸类 有机酸类主要存在于刺五加和五味子中，绿原酸来自刺五加和五味子，该化合物在负离子模式下有2 种裂解途经，一种为准分子离子峰m／z353.087 2［M-H］-失去一个脱水咖啡酸中性离子，得到基峰碎片离子m／z191.055 2［M-H-C9H6O3］-，该离子又失去一个中性离子H2O，产生碎片离子m／z173.044 8［M-H-C9H6O3-H2O］-，该途径证明结构中存在奎宁酸；另一种裂解方式为准分子离子峰裂解失去脱水奎宁酸中性离子，产生碎片离子m／z179.034 3［M-H-C7H10O5］-，脱去COO，产生碎片离子m／z135.045 1［M-H-C7H10O5-COO］-，该途径证明结构中存在咖啡酸，由此可以推断绿原酸结构。参考文献［23］，对比绿原酸对照品的二级质谱图，见图10，推断为绿原酸，其裂解途经见图11。

图7 五味子醇甲裂解途径

图8 佛手柑内酯正离子模式下二级质谱图

图9 佛手柑内酯裂解途径

除以上4 类化合物外，方中还有萜类、甾体类、生物碱类等化合物。萜类成分主要来自白术和五味子，白术中主要含有倍半萜类，目前对其裂解规律报道较少；甾体类成分来自麦冬，其裂解方式独特，可能发生麦氏重排，如薯蓣皂苷元；方中还鉴别出部分生物碱类成分，如腺苷。

4 讨论

图10 绿原酸负离子模式下二级质谱图

图11 绿原酸裂解途径

文献报道，黄芪中黄酮类成分，能抗病毒［24］，还能改善机体免疫功能失调［25］、改善肺纤维化肺功能［26］。防风中的升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷等色原酮类成分具有解热［27］、抗炎［28］等作用。白术中的白术内酯Ⅲ等内酯类成分具有抗炎作用［29］。刺五加中含有的刺五加苷类及黄酮类成分，具有调节免疫功能的作用［30］。五味子中的木脂素类成分，具有免疫调节、体内抗炎等作用［31］。麦冬中的鲁斯可皂苷元等甾体类成分具有抗炎作用，黄酮类成分具有免疫调节、抗炎、镇咳、改善肝肺损伤等作用［32］。这些化合物有可能是芪风固表颗粒的药效物质基础。

本实验利用UPLC-Q-TOF-MS 技术，快速全面的对芪风固表颗粒中的体外物质成分进行了初步定性分析，通过与部分对照品数据及二级质谱图的比较，最终分析和推断了芪风固表颗粒中的110个化合物，其中有37个黄酮类，18个木脂素类，10个香豆素类，19个有机酸类，此外还有萜类、甾体类、生物碱类等其他类型。本实验分析推测了以上110个化合物的质谱裂解途径，并对所有化学成分进行了药材来源归属，以期为芪风固表颗粒的药效物质基础溯源及质量标准提升研究提供依据。