藻菌共生小球的制备及其脱氮效能

■李科静 周诗琪 聂凌云 葛燕婷 余建波 李德亮

（湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128）

水产养殖业是我国农业的重要组成部分，在提供优质动物蛋白和改善居民膳食结构方面做出了突出的贡献。2019年，全年水产品产量6,450万t，其中养殖水产品产量5,050万t，养殖产量连续30年稳居世界第一（2019年国民经济和社会发展统计公报）。近年来，随着产业集约化和规模化程度的不断增强，水产养殖业对水域环境的潜在威胁日益受到政府和社会的高度关注。氨氮和亚硝酸盐氮不仅是养殖尾水排放监管的两大重要指标，而且高浓度的氨氮和亚硝酸盐能损害养殖对象的组织结构、生理特征和代谢能力，从而导致大量死亡。随着国家水产养殖尾水污染物排放相关规范标准的相继出台，养殖水体的综合治理与修复将成为水产养殖业日常管理的重要内容之一，研发养殖水体营养盐原位修复技术和养殖尾水异位净化技术也必将成为水产养殖业所面临的重要产业和技术问题。

藻—菌共生体系顾名思义为藻类和菌类之间通过协调作用达到净化水体目的的一种共生技术体系。水中的有机污染物经好氧型细菌氧化分解产生CO2和NH4+、PO4

3-等无机成分，能被藻类所吸收，且经叶绿素的光合作用合成自身细胞物质，并释放O2供细菌继续氧化有机物之用。目前，藻菌共生技术中常用的微藻主要有螺旋藻、小球藻、铜绿微囊藻、衣藻、月牙藻、栅藻、短带鞘藻、念珠藻、褐胞藻等，而常用的菌类有硝化细菌、芽孢杆菌、曲霉菌、黄曲霉、黑曲霉、烟曲霉等。尽管如此，小球藻和米曲霉共生体系在养殖水体脱氮除磷方面的应用还相对较少。为此，本研究通过制备小球藻与米曲霉的共生体系，分析该共生体系对水中氨氮、亚硝酸盐氮的去除能力，以期为池塘养殖水体的净化和修复处理提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 小球藻和米曲霉培养

实验用普通小球藻（Chlorellavulgaris）和米曲霉（Aspergillusoryzae）均由中南大学环境与水资源研究中心提供。BG11为培养基，小球藻于26℃、光照强度4,000lx、12L∶12D条件下批量培养，待其生长至对数期，4,000rpm离心5min，去上清，收集藻细胞。米曲霉的培养方法，即将米曲霉孢子接种于pH值7.0的改良马丁固体培养基后，置于28℃的恒温箱中培养3～5d，待其长出黄绿色孢子后，将菌种置于改良马丁固体培养基中并4℃保存，备用。

图1 不同小球藻密度条件下形成的藻菌共生小球

1.2 共生小球的构建

将米曲霉孢子接种于盛有无菌改良马丁液体培养基的250mL锥形瓶中，轻摇1min，封口，置于28℃的恒温振荡器中，160r/min震荡培养48h，形成稳定的白色真菌小球。将 350个左右真菌小球用灭菌的生理盐水冲洗2～3次后分别置于细胞密度为3×106、6×106、9×106、12×106、15×106、18×106、21×106cell/mL的锥形瓶中，置于26 ℃的恒温振荡器中、光照强度1,800lx、160r/min，12L∶12D条件下培养与小球藻共同培养，制备藻菌共生小球。每个处理组重复3次。培养24h后，轻轻混匀培养液，取少量培养液、0.45μm 针式过滤器过滤，分光光度计测定滤液吸光度，以确定培养液中藻细胞密度，从而评价米曲霉小球对小球藻的固定率。

1.3 共生小球的脱氮效能

取350个真菌小球放入250mL锥形瓶中与小球藻共同培养，小球藻密度为8.75×106（固定率最优组）的培养液中培养，形成稳定的藻-菌共生小球体系备用。在该共生体系中添加氯化铵和亚硝酸钠使氨氮（NH3-N）和亚硝酸盐氮（NO2--N）终浓度分别达到2.0mg/L和1.0mg/L。重复4次。分别于共同培养后1、3、6、9、12、24、48h后取少量培养液，用0.45μm针式过滤器过滤后，采用德国CleverChem全自动化学分析仪测定其NH3-N和NO2-N含量。

1.4 数据分析

图2 米曲霉小球对不同密度小球藻的固定率

图3 藻菌共生小球对NH3-N和NO2-N的去除情况

米曲霉小球对小球藻的固定率=（初始藻细胞密度-取样时藻细胞密度）/初始藻细胞密度。分别采用Excel2016和SPSS22.0软件进行数据统计与分析，Origin9.0软件制图。

2 结果

2.1 藻菌共生小球的制备与优化

图1显示，分别将350个米曲霉真菌小球放入藻细胞密度为3×106、6×106、9×106、12×106、15×106、18×106、21×106cell/mL的锥形瓶中，与小球藻混合震荡培养24h后，培养液中藻细胞会逐步附着在真菌小球表面，真菌小球由白色变成浅绿色。锥形瓶中的培养液颜色会随着藻细胞被米曲霉小球固定由深绿色逐渐变浅，直至清澈透明，但不同藻细胞密度与真菌小球的结合情况不同，形成颜色深浅不同的共生小球。藻细胞密度为15×106、18×106、21×106cell/mL时真菌小球对藻细胞的固定效果相对较差，表现为培养液颜色呈现藻细胞的绿色。

以共生体系培养基中藻细胞初始密度为横坐标，米曲霉小球对小球藻的固定率为纵坐标，拟合的细胞密度与固定率曲线呈现先上升后下降的整体趋势 （图2）。该曲线的回归方程为y=-4×10-13x2+7×10-6x+66.558（R2=0.908）。经计算得知，藻细胞密度为8.75×106cell/mL时，米曲霉菌小球对小球藻的固定率最高。

2.2 藻菌共生小球的脱氮效能

实验期间，对照组NH3-N含量总体保持稳定，在初始值1.126mg/L基础上轻微波动。藻菌共生小球组培养液中NH3-N含量随实验时间的延长呈现显著的下降趋势，在9h时去除率达到了最大值99.0%。实验结束时氨氮平均浓度为0.085mg/L（图3）。对照组NO2-N含量总体保持稳定，在初始值1.114mg/L基础上轻微波动。实验开始12h后，藻菌共生小球组培养液中NO2-N去除率达到最大值 99.8% （图3）。

3 讨论

藻菌共生体系是通过藻类和菌类之间协调作用而达到净化水体的一种生物处理技术体系。水体中的有机污染物，经藻菌共生体系中好氧型细菌氧化分解产生CO2和 NH4+、PO43-等营养盐，藻类吸收这些营养盐并通过叶绿素的光合作用合成自身细胞物质，释放 O2供细菌继续氧化有机物之用。因此，藻菌共生技术因具有效果好、周期短、二次污染小、成本低和易回收等优点而展示广阔的应用前景。本研究采用小球藻和米曲霉来制备藻菌共生体系，发现将小球藻细胞密度从3×106cell/mL 开始升高到21×106cell/mL，米曲霉小球对小球藻的固定率随着藻细胞密度呈现先增后降的趋势，经方程拟合计算，密度为8.75×106cell/mL 时米曲霉小球对小球藻细胞的固定效率最佳，这为下一步利用藻菌共生小球对水体进行脱氮处理研究与实践奠定基础。

养殖水体中含有大量的氮、磷营养盐，高浓度的氨氮和亚硝酸盐不但能损害养殖对象的组织结构、生理特征和代谢能力，导致养殖对象的大量死亡，也能对渔业环境造成影响。因此，氨氮和亚硝酸盐氮也是养殖尾水排放重点监控指标。大量研究显示，藻菌共生体系可以有效地去除养殖水体中的氮磷营养盐。共生体系中地衣芽孢杆菌、硝化细菌、月芽藻、四尾栅藻比例为1∶2∶2∶2时，对养殖废水 NH4+-N、NO2--N、NO3--N 和TP 的去除效果最佳，去除率分别达到89.16%、100%、98.62%和100%。小球藻和芽孢杆菌共生系统对海水养殖尾水的中NH4+-N、PO43+-P、TP和CODMn的去除率分别为 96.57%、98.62%、89.89% 和 39.09%。本研究制备的米曲霉和小球藻共生小球能够有效的去除水中NH3-N和 NO2-N，且在12h内去除率几乎接近100%（图3），进一步证实通过合适的藻菌共生体系，可以有效地消除养殖水体氮营养盐。本研究构建的小球藻和米曲霉共生小球具有起效速度快，去除效率高等优点，在水体净化处理方面具有较大的应用潜力。尽管如此，该藻菌共生系统在养殖尾水处理的产业化应用方面，仍面临诸多问题，如共生小球在养殖水体中的去除效率、共生小球固定载体的选择、载体的固定效率和共生小球的回收等均有待于进一步地深入研究与试验，而这些也是未来藻菌共生技术的研究方向。（参考文献略）