Zebularine和Scriptaid对绵羊卵丘细胞重编程的影响

刘梦蝶，李志斌，房晓欢，王 卓，聂雨欣，石霖静，李俊杰，2*

（1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技术创新中心，河北 保定 071000）

体细胞核移植（SCNT）技术在加快品种改良、缩短家畜繁殖周期等方面有重要应用，但克隆效率低下，制约着该技术的发展，其中供体细胞不完全重编程是影响SCNT效率的关键因素［1］。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是两种重要的表观遗传修饰方式。研究表明，DNA甲基化水平偏高或组蛋白乙酰化水平偏低是SCNT胚胎发育能力低的重要原因［2-3］。Zebularine是DNA甲基转移酶抑制剂，添加Zebularine可显著提高猪［4］、水牛［5］SCNT囊胚发育率；Scriptaid是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，处理猪［6］和牛［7］SCNT重构胚，会使胚胎体外发育能力显著提高。河北农业大学动物科技学院繁殖实验室曾利用Zebularine和Scriptaid处理绵羊SCNT胚胎，均显著提高了早期胚胎体外发育能力［8-10］。SCNT胚胎表观遗传修饰异常的根源与供体细胞的分化存在密切联系，供体体细胞核移入去核卵母细胞后需经过表观遗传重编程过程，回到胚胎起始发育的全能状态。为此，Zebularine和Scriptaid处理供体细胞后对SCNT胚胎发育的影响受到广泛关注，Xiong X.等［11］利用Zebularine和Scriptaid处理牛成纤维细胞，增加了牛SCNT胚胎的体外发育潜力和质量。但用Zebularine和Scriptaid等表观遗传修饰试剂处理供体细胞后，对细胞增殖、发育潜能等的影响未见报道，为此，本试验采用Zebularine和Scriptaid处理绵羊卵丘细胞，研究对细胞增殖、多潜能基因、转化生长因子及甲基转移酶等表达的影响，探讨表观遗传修饰试剂提高绵羊SCNT胚胎发育能力的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 卵母细胞的采集和培养

绵羊卵巢，采集于河北省保定市唐县某屠宰场。绵羊屠宰后挑选新鲜的卵巢，于3 h内送回实验室，将卵巢上直径3～6 mm的卵泡切开，在预热至37℃的培养液中滤出卵丘、卵母细胞复合物（COCs），在体式显微镜下选择具有3层及以上卵丘细胞包被且胞浆均匀的COCs用于试验。将获得的复合物放置于成熟培养液中，在38.6℃、5%CO2恒温培养箱中进行体外成熟。

1.2 卵丘细胞的选取和培养

将成熟后的COCs置于透明质酸酶中，用枪头反复吹打使卵丘和卵母细胞分离，收集卵丘细胞并加入卵丘培养液，在38.6℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养，当卵丘细胞生长汇合至80%～90%时开始传代。本试验使用的是第三代卵丘细胞。

1.3 卵丘细胞的处理与分组

根据前期试验结果，Zebularine（Z4775 Sigma）和Scriptaid（S7817 Sigma）的最佳处理浓度和时间分别为5 nmol／L、12 h［8］和0.2μmol／L、12 h［9］。因此，本试验设置3个试验组，5 nmol／L Zebularine（Z组）和0.2μmol／L Scriptaid单独处理（S组）及联合处理（SZ组）卵丘细胞12 h，及1个不进行药物处理的对照组。

1.4 MTT法检测细胞增殖情况

将制成细胞悬液的卵丘细胞按每孔8 000个接种于96孔细胞培养板中，每孔终体积为200μL。每组设6个重复孔，于38.6℃培养箱中培养12 h后弃去上清液，每孔加入90μL培养基（康宁）和10μL碧云天（MTT）溶液，38.6℃继续培养4 h后吸去培养基，每孔加入110μL Formazan放于水平摇床上低速振荡10 min（另设6个调零孔和6个对照孔）。用酶联免疫检测仪在490 nm处测量各孔吸光度，根据吸光度计算细胞增殖率。吸光度值越大细胞增殖率越高［12］。

1.5 RNA的提取、反转录及引物条件的确定

RNA提取步骤参照RNA Simple Toal RNA Kit总RNA提取试剂盒（TIANGEN）说明书进行，从各组卵丘细胞中提取总RNA；测定RNA的浓度及纯度，符合试验要求的RNA放于-80℃长期保存，防止降解。提取的绵羊卵丘细胞总RNA进行反转录，得到cDNA，保存于-20℃，用于后续试验。

利用引物合成软件Primer premier，得到目的基因和内参基因的引物序列，序列见表1。

表1 目的基因引物序列

1.6 实时荧光定量PCR

分别以4组卵丘细胞cDNA为模板，以βactin为内参进行实时荧光定量PCR检测，读取目的基因、内参基因的Ct值，用△Ct法（Qr＝2-△△Ct）计算各基因在绵羊卵丘细胞中的相对表达量。

1.7 数据的统计分析

每组试验重复3次，数据结果使用SPSS软件进行单因素方差分析、邓肯氏多重检验，从而得到差异性检验结果。P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 MTT法检测各处理组细胞的增殖情况

见图1。

由图1可知，与对照组相比，Zebularine、Scriptaid联合处理及单独处理后卵丘细胞吸光度差异 不 显 著（P ＞0.05），证明Zebularine与Scriptaid处理后不会对卵丘细胞增殖产生不良影响。

2.2 荧光定量PCR检测基因表达情况数据分析

采用2-△△Ct方法计算基因相对表达量，结果见图2～6。

由图2～6可知：与对照组相比，单独使用5 nmol／L Zebularine或0.2μmol／L Scriptaid处理卵丘细胞，多潜能基因Oct4相对表达量显著增加（P＜0.05）；BMP15和Sox2相对表达量增加但与对照组差异不显著（P＞0.05）；Zebularine处理后卵丘细胞GDF9基因相对表达量显著提高（P＜0.05）；单独及联合使用两种试剂处理后DNMT1相对表达量均显著降低（P＜0.05）。

3 讨论

自体细胞克隆羊多利降生以来，SCNT技术取得了重要进展，但供体细胞DNA甲基化水平过高或者组蛋白乙酰化水平过低仍然是影响SCNT效率提高的重要问题［4，9］。Zebularine和Scriptaid分别是近年来常用的DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂，具有毒性低、效率高的特点。本试验利用Zebularine、Scriptaid单独处理和联合处理后，对卵丘细胞的增殖率没有显著影响，证明两种药物处理对卵丘细胞的增殖无不良影响。这与阮秋燕等［13］用Scriptaid处理水牛胎儿成纤维细胞的结果相一致。

Oct4是多能性调控网络中的关键因子，Sox2是一种编码转录因子的基因，二者与细胞的发育潜能存在着密切联系。在本试验中，Zebularine或Scriptaid单独处理卵丘细胞，多潜能基因Oct4相对表达量与对照组相比差异显著，联合处理对表达无影响。Xiong X.等［11］报道，Zebularine或Zebularine＋Scriptaid联合处理牦牛成纤维细胞可使Oct4和Sox2相对表达量增加，进而提高SCNT胚胎发育能力，本试验结果与其相似；卢富春等［14］在猪上也得到了相似的结果。

BMP15和GDF9是由卵母细胞分泌的两个生长因子，属TGFβ超家族成员。BMP15和GDF9能与卵丘细胞上的受体结合，引起下游基因的级联反应，影响卵丘细胞的增殖和凋亡，从而调节卵泡发育与卵母细胞成熟［15］。Du M.等［16］检测了GDF9在组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）处理后样品中的表达水平，结果TSA对GDF9的表达无显著影响（P＞0.05）。在卵母细胞来源的因子中，BMP15可促进卵泡生长并被认为具有表观遗传效应。

DNMT1是重要的DNA甲基转移酶，其主要作用是维持甲基化［17］。研究表明，Zebularine可以使DNMT1表达降低或完全缺失［9］，推测其主要是通过抑制DNMT1的表达来降低供体细胞的DNA甲基化水平。在本试验中，使用 Zebularine和Scriptaid单独或联合处理卵丘细胞，均使DNMT1表达量显著降低。

值得注意的是，Zebularine和Scriptaid联合处理绵羊卵丘细胞后，Oct4、Sox2、BMP15和GDF9表达量虽然均高于对照组，但均低于Zebularine或Scriptaid单独处理，这可能与这两种药物仍具有一定的化学毒性有关；或是如果联用两种药物处理供体体细胞，其最佳剂量和作用时间有待深入研究。 总之，Zebularine和Scriptaid单独及联合处理绵羊卵丘细胞，对细胞增殖无显著影响，但可提高多潜能基因（Oct4、Sox2）、细胞分化相关基因（BMP15、GDF9）表达量，降低DNA甲基化相关基因（DNMT1）表达，表明Zebularine和Scriptaid对绵羊卵丘细胞重编程研究具有重要意义。