细胞因子IL-17E、IL-17F及其受体在前列腺癌组织中的表达及意义

刘 杰，刘艳波，杨丽娟，沈维高，闫 萌，郭 鹏

(1.北华大学医学院，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院附属医院，吉林 吉林 132011；3.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

目前，中老年男性前列腺癌发病率呈明显上升趋势，前列腺在内外环境因素的长期作用下，极易出现慢性前列腺炎及良性前列腺增生，若维持炎症产生的微环境持续存在，前列腺组织内积聚大量的炎性细胞，持续分泌细胞因子及炎症介质，这些细胞因子和炎症介质对前列腺细胞造成严重损伤，细胞在不断增生和修复过程中，可出现少数驱动癌症的变异细胞[1].在前列腺增生过程中多种炎细胞积聚，其中CD4+T细胞亚型Th17细胞及其分泌的细胞因子在前列腺癌的发生发展中发挥着重要作用.Th17细胞可分泌多种细胞因子，其分泌的细胞因子如白细胞介素17A(IL-17A)、白细胞介素17E(IL-17E)和白细胞介素17F(IL-17F)在多种肿瘤和慢性感染中发挥关键作用.本课题组前期研究[2]证实，IL-17A及其受体白细胞介素17RA(IL-17RA)促进了前列腺癌的发生发展.IL-17E和IL-17F可在多种炎症性疾病和自身免疫性疾病中发挥作用，但其与前列腺癌的关系鲜有报道.

因此，本研究通过检测IL-17E及其受体IL-17RB、IL-17F及其受体IL-17RC在各种前列腺组织中的表达差异，探讨配体与相关受体之间的相关性以及与前列腺癌恶性度之间的关系，为前列腺癌的诊治提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取吉林大学前列腺癌防治研究中心、北华大学附属医院和吉林医药学院附属医院提供的前列腺组织标本65例，其中正常前列腺标本6例，患者年龄50～61岁，平均(55.0±12.4)岁，均经直肠穿刺活检取得；良性前列腺增生标本39例，患者年龄53～70岁，平均(61.0±21.3)岁，前列腺穿刺活检或术中取样获得；前列腺癌标本20例，患者年龄54～76岁，平均(58.0±18.8)岁，前列腺组织标本通过穿刺或手术获得.本研究均符合医学伦理学要求，受试者均对该研究知情，标本经HE染色，由两名专业的病理学医师明确病理诊断.

1.2 主要仪器设备

显微镜(BX53，奥林巴斯公司，日本)；台式低速离心机(L400，湘仪集团)；电子天平(FA1004B，上海圣科仪器有限公司)；海尔冰箱(BCD-539，青岛海尔公司)；酸度计(LR-PH-S25，杭州联测自动化技术有限公司)；移液器(eppendorf，德国)；磁力搅拌器(CL-1A，上海一科仪器有限公司)；灭菌锅(YX-280A-24L，广州康迈医疗器械有限公司)；电热鼓风干燥箱(长沙市秋龙仪器设备有限公司).

1.3 主要试剂

实验所使用的一抗名称及稀释浓度见表1.二抗(通用型PV9000试剂盒，中杉金桥试剂公司)；DAB显色液(中杉金桥试剂公司)；二甲苯、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、枸橼酸、酒精、氯化钠、氯化钾、枸橼酸钠、苏木素和中性树胶等均为国产分析纯试剂.

表1 实验所用一抗及相关信息

1.4 主要方法

应用免疫组织化学染色法检测IL-17E、IL-17F、IL-17RB和IL-17RC表达，将石蜡包埋的标本进行序列切片，粘贴在富含阳离子树脂的载玻片上，常规二甲苯脱蜡30 min，梯度酒精脱水，应用磷酸盐缓冲液充分漂洗3次；利用高温高压法进行抗原修复(0.01 mol枸橼酸缓冲液，pH 6.0)，待修复液冷却至室温后应用磷酸盐缓冲液充分漂洗3次；利用新鲜配制的1% H2O2灭活内源性过氧化物酶60 min；滴加不同稀释度的一抗(IL-17E、IL-17F、IL-17RB和IL-17RC)，常温孵育过夜，磷酸盐缓冲液充分漂洗3次，每次3 min；滴加通用型二抗(辣根过氧化物酶标记，二抗加5%的血清(AB血型))，常温孵育30 min，应用磷酸盐缓冲液充分漂洗3次；DAB溶液显色，显微镜下观察，待染色区域的颜色高于本底时，使用自来水充分冲洗，终止反应，苏木素轻度复染，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，干燥，封片.

1.5 结果判断及处理

每种抗体稀释倍数固定，染色时间相同，由两名经验丰富的病理医师双盲法阅片.当棕黄色颗粒高于本底时定位阳性.200倍显微镜下连续拍摄每一张组织切片，在相同条件下利用Image-pro plus软件对图片进行平均光密度值分析.平均光密度值越大，说明组织染色越强.IL-17E和IL-17RB、IL-17F和IL-17RC阳性表达率计算方法：阳性表达率=阳性面积/整个染色切片面积×100%.

1.6 统计学分析

应用 Minitab for Windows、Minitab Release 9.2、Minitab、Inc、State College、PA对数据进行处理与统计学分析，利用Image-proplus对图像进行平均光密度值分析，所得数据以Excel格式输出，组间比较行t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结 果

2.1 IL-17E及其受体IL-17RB在前列腺组织中的表达

为检测前列腺相关组织细胞因子IL-17E和IL-17RB的表达情况，本研究应用免疫组化染色技术检测6例NP、39例BPH和20例Pca 标本IL-17E及IL-17RB的分泌、表达及定位，结果显示：IL-17E阳性颗粒呈棕黄色，主要表达于腺上皮细胞和单个核细胞，在血管内皮细胞以及癌细胞中也有少量表达，IL-17E代表性染色见图1.经统计学分析得知，NP及BPH中IL-17E表达均明显高于Pca(P<0.05).见表2.

IL-17RB阳性颗粒呈棕黄色，主要表达于组织的单个核细胞和腺上皮细胞，偶见于癌细胞内，其代表性染色见图1.与BPH和NP比较，Pca内IL-17RB的表达明显增高，且差异具有统计学意义(P<0.05).BPH组织内IL-17RB表达增加，但与NP比较差异无统计学意义(P>0.05).见表2.

表2 前列腺组织中IL-17E和IL-17RB分泌及表达

病理类型nη/%IL-17EIL-17RBPca203.84±1.63◆※6.82±2.33◆BPH395.98±0.955.33±1.37◆NP65.77±0.442.46±0.97

注：◆.与NP比较P<0.05；※.与BPH比较P<0.05.

2.2 IL-17F及其受体IL-17RC在前列腺组织中的表达

为检测前列腺组织细胞因子IL-17F和IL-17RC的表达情况，本研究同样应用免疫组化方法检测了IL-17F及其受体IL-17RC表达及定位情况，结果显示：IL-17F阳性颗粒呈棕黄色，主要表达于腺上皮细胞、单个核细胞及血管内皮细胞内，其在前列腺癌细胞的表达明显增强.与BPH和NP比较，在Pca中IL-17F分泌明显增加(P<0.05)，IL-17F代表性染色见图2，统计学分析见表3.

IL-17RC阳性颗粒呈棕黄色，主要表达部位与IL-17F相似，其代表性的染色见图2.与BPH和NP比较，Pca内IL-17RC的表达明显增高，与NP及BPH比较差异具有统计学意义(P<0.05).见表3.

2.3 不同组别中IL-17E和IL-17F与受体表达相关性分析

将不同前列腺组织IL-17E及受体IL-17RB、IL-17F及受体IL-17RC进行相关性分析，结果发现：在前列腺癌组织IL-17F与受体IL-17RC呈正相关(相关系数为0.62),而在正常前列腺和良性前列腺癌组织相关配体及受体间未发现明显的相关关系.

表3 前列腺组织中IL-17F和IL-17RC分泌及表达

病理类型nη/%IL-17FIL-17RCPca组208.97±2.24◆※6.64±2.03◆※BPH组395.74±1.35◆3.67±1.08◆NP组62.76±1.440.78±0.25

注：◆.与NP比较P<0.05；※.与BPH比较P<0.05.

2.4 IL-17E和IL-17F与前列腺癌恶性度关系

20例前列腺癌组织经HE染色后由专业的病理医师进行Gleason分级，并达成共识，分别统计IL-17E及IL-17F在不同病理分级标本的表达情况.结果显示：Gleason评分4～6分时，IL-17E的表达最强，不同病理分级之间比较差异具有统计学意义(P<0.05)；而Gleason评分8～10分时，IL-17F的表达最强，不同分级之间差异具有统计学意义(P<0.05).即Gleason评分越高，IL-17E的表达越低，而IL-17F的表达则增加.见表4.

表4 前列腺癌组织中IL-17E和IL-17F与Gleason分级关系

注：◆.与低Gleason评分(4～6分)比较P<0.05.

3 讨 论

恶性肿瘤的形成并非单一因素所致，它是一个多因素、多阶段的过程，随着免疫医学与分子生物学的研究进展，细胞因子与恶性肿瘤的关系已成为近年来研究的热点问题[3].由Th细胞分泌的IL-17家族在转录调控及免疫功能方面具有良好的特性.IL-17家族包括IL-17A～F 6种配体及IL-17RA～RE 5种不同的受体[4].IL-17与多种恶性肿瘤相关，如卵巢癌、皮肤癌、脑瘤等[5].目前研究最多的是在致炎和抗炎过程中IL-17A、IL-17E和IL-17F的作用.

IL-17E也被称作IL-25，可由极化的Th细胞分泌，同时肺上皮细胞、肠道上皮细胞以及肺内的嗜酸性、嗜碱性粒细胞和肥大细胞等都可分泌.研究[6]发现，高表达的IL-17E可参与变态反应性气道炎症、免疫性皮肤病和关节炎性疾病的发生发展.遵循受体与配体结合原则，IL-17E可与其特异性受体IL-17RB结合，二者形成的二聚体可进一步控制下游的信号传导[7].本研究采用免疫组织化学染色法检测IL-17E及其受体IL-17RB在BP、BPH和Pca组织中表达差异，结果显示：IL-17E及其受体IL-17RB主要分布在单核细胞、腺上皮细胞、血管内皮细胞和部分癌细胞，IL-17E在NP及BPH表达明显强于Pca.有研究[8-9]显示：IL-17E基因缺失或突变可诱发肾癌、急性髓细胞性白血病、肺癌和乳腺癌等，在人源性肿瘤细胞异体模型中，注射重组的IL-17E蛋白可抑制肿瘤的生长，其机制一般认为与B细胞激活有关；在小鼠肿瘤模型中，给予IL-17E或与化疗药物联合应用，发现IL-17E具有抗肿瘤效应或提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性.最近研究[10-11]证实：IL-17E通过活化嗜酸性粒细胞，在诱导乳腺癌细胞凋亡的过程中发挥重要作用，可以用作乳腺癌治疗的理想靶点.因此，推测IL-17E可能具有抑癌效应，但对前列腺癌的抑制作用还需进一步探讨.

Th17细胞、CD8+T细胞、γδT细胞和NK细胞等均可分泌IL-17F.IL-17F与IL-17A同源性最接近，因此在功能上也具有相似的特征性，同样遵循受体与配体相结合原则，IL-17F与IL-17A均可与其受体IL-17RC及IL-17RA结合，从而进一步介导下游的信号传导.IL-17F能在正常的人类结肠上皮细胞中表达，在结肠癌荷瘤小鼠模型中超表达的IL-17F能抑制小鼠体内肿瘤生长，IL-17F的缺乏抑制了小肠肿瘤在基因敲除小鼠体内发生[12].我们的前期工作[9]证实：IL-17F在膀胱癌组织高表达.为进一步明确IL-17F及其受体IL-17RB在前列腺癌中的作用，本研究采用免疫组织化学染色法检测其在不同前列腺组织中的表达差异，结果显示：IL-17F及其受体IL-17RC在Pca组织中高表达，说明组织样本中高水平的IL-17/IL-17R分泌可能有利于肿瘤细胞的生长和转移，提示IL-17F可能参与前列腺癌的发生发展.

同时我们也检测了IL-17E、IL-17F与其相关受体在前列腺癌组织内表达的相关性，相关性分析结果表明，IL-17F与IL-17RC呈正相关关系.对IL-17E和IL-17F的表达与前列腺癌Gleason分级进行统计学分析，结果显示：随着Gleason分级升高，前列腺癌组织中IL-17E阳性表达率降低，而IL-17F阳性表达率增高，说明IL-17F及其受体IL-17RC可能参与了前列腺癌的发生发展，并且二者的表达程度可能在一定程度上反映了前列腺癌的恶性程度，但其促癌的具体机制还需进一步研究.

本研究通过对比IL-17E及其受体IL-17RB和IL-17F及其受体IL-17RC在NP、BPH以及Pca组织中的表达差异，分析IL-17E和IL-17F与受体之间的相关性以及与前列腺癌恶性度之间的关系，探讨他们在前列腺癌发生发展中的作用及意义，为前列腺癌的防治提供理论依据.但本研究也存在不足之处：本研究的研究方法单一，标本数量偏少，可能对最终结论有一定影响，因此需要进一步加大样本量，进行IL-17E和IL-17F重组蛋白对前列腺癌影响的体内外研究，并进行相关机制探讨.