白花丹醌对大鼠肝细胞肝癌自噬活性的影响并机制初探

2020-07-07陈金霞林文雅张友才

世界华人消化杂志 2020年12期

陈懿,李雪,陈金霞,林文雅,张友才

陈懿,李雪,陈金霞,林文雅,张友才,温州医科大学附属第一医院感染内科浙江省温州市 325000

0 引言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)恶性程度高,发展迅速,且易于复发.手术难以切除或失去根治机会,对化疗药物不敏感,经导管动脉化疗栓塞术等可能会加重癌肿组织缺血、缺氧,改变肿瘤细胞内基因转录活性,启动应激反应,诱导肿瘤细胞逃逸凋亡,是严重危害人类生命健康的重大疾病之一.

PI3K/AKT/mTOR信号通路在细胞适应生理条件和环境压力过程中,发挥极其重要的负向调节作用,是自噬启动阶段的关键分子之一,同时参与肿瘤细胞迁移、黏附、细胞基质的降解[1,2].白花丹醌是天然的植物化学物质,具有抗菌、抗氧化、抗肝损伤以及逆转肝纤维化的作用[3-5].有报道称白花丹醌可能通过PI3K/AKT信号传导途径,影响肿瘤细胞自噬活性,具有抗肿瘤作用[6,7].但其对肝细胞癌的发生和进展的影响目前仍未见报道.本研究拟借助黄曲霉毒素B1 (aflatoxin B1,AFB1)诱导型大鼠HCC模型,研究中药白花丹醌对大鼠早期HCC细胞自噬活性的影响,并探讨其抗肝细胞癌机制是否与PI3K/AKT信号通路相关.

1 材料和方法

1.1 材料 4周龄清洁级近交系雄性Wistar大鼠,体重60-80 g,由中国科学院上海实验动物中心提供.AFB1为美国Sigma公司产品(批号A6636),白花丹醌购自美国Sigma公司,二甲基亚砜(DMSO)和2-乙酰氨基芴(2-AAF)购于广州伟伯化工有限公司(编号226388、304-28-9),2-AFF饲料为将基本饲料粉碎后,按150 g/1000 g比例充分混合而成.总RNA提取(TaKaRa RNAiso Plus)、cDNA合成及RT-PCR扩增试剂盒(TaKaRa RNA PCR Kit 3.0)均为大连宝生物工程有限公司产品.Akt抗体购自上海雷浩信息科技有限公司; 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)一抗购自武汉博士德生物工程有限公司; 二抗、二氨基联苯胺(DAB)购自北京中衫金桥生物技术有限公司.兔抗LC3B抗体(北京华夏远洋科技有限公司,产品编号：AL221).二喹啉甲酸(BCA)购自上海润成生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立： 55只雄性Wistar大鼠按清洁级动物要求养在温州医科大学实验动物中心,温度控制在24℃±1 ℃,相对湿度45%-70%.基本饲料安静饲养1 wk后分成对照组,AFB1诱癌模型组、2 mg/kg白花丹醌处理组和3 mg/kg白花丹醌处理组; 对照组10只,其他每组15只.对照组给予0.9%氯化纳溶液 2 mL/Kg腹腔注射,其他组大鼠腹腔注射AFB1 (400 μg/kg,AFB1用15 mL DMSO溶剂混匀),每周6次,持续2 wk; 2-AFF饲料喂养2 wk后,重复上述制作过程(13 wk后用基本饲料喂养),于37周时停药[8].白花丹醌处理组大鼠在应用AFB1基础上,于第6周起腹腔注射白花丹醌,每周2次.于实验第37周断颈处死所有大鼠.模型制作过程中任大鼠自由饮水、进食.

1.2.2 透射电镜组织超微病理观察：将所取新鲜肝组织切成1 mm3大小,用2.5%戊二醛固定,PBS 漂洗后,1%锇酸固定,制成2 μm超薄切片,用醋酸双氧铀、枸椽酸铅双重染色,HITACHI日本H-7500型透射电镜观察.

1.2.3 AKT1mRNA表达(RT-PCR)：用RNAiso Plus试剂提取总R N A,紫外分光光度计测吸光度(A)值,以A260/A280=1.8-2.0为RNA质量判断标准.按试剂盒说明书要求合成cDNA.AKT1上游引物： 5’-CCACAGGTCGCTACTATGCC-3’,下游引物： 5’-GTCCAGGGCGGACACAATCT-3’; GAPDH上游引物5’-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3’,下游引物5’-CACCAGTGGATGCAGGGAT-3’; 产物长度分别为275 bp、477 bp.反应条件： 94 ℃预变性5 min后,95 ℃ 30 s,52℃ 30 s,72 ℃ 45 s,循环30次后,72 ℃延伸5 min.取PCR反应产物5 μL,用2%琼脂糖凝胶电泳分离后,在凝胶成像系统(Biosens Sc 810)分析结果.

1.2.4 AKT1免疫组织化学染色：按过氧化物酶标记链霉亲和素法试剂盒说明书操作.60 ℃烤片1 h,二甲苯、乙醇脱蜡至水,3%过氧化氢溶液 37 ℃温育阻断内源性过氧化物酶,0.01%枸橼酸缓冲液高压修复,自然冷却后滴加AKT1一抗(1：50稀释),4 ℃温育过夜; 滴加二抗及链霉亲和素-过氧化物酶,DAB显色,苏木精复染,脱水、封片.用PBS代替一抗作阴性对照.

1.2.5 Western Blot检测肝组织中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白：自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低.取-80 ℃保存的肝组织,各组大鼠肝组织均取0.1 g,冰浴,加500 μL组织裂解液和5 μL 磷酸酶抑制剂,冰浴匀浆,4 ℃,以13800Íg离心10 min,收集上清液置-80 ℃冰箱保存.使用前用BCA蛋白浓度检测法检测蛋白水平,蛋白稀释至50 ng/μL 后取15 μL上样,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜至二氟化树脂膜,5%脱脂奶粉封闭,一抗封闭4 ℃过夜,二抗(羊抗兔) 37 ℃温育1 h,增强化学发光法检测蛋白表达,Gel-Pro 3.1软件测定各条带的灰度值,经内参照GAPDH校正后得到蛋白相对表达量.

统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学处理,计量数据用mean±SD表示,各组样本均数比较采用单因素方差分析,Levene法检验方差齐性,方差齐时采用LSD-t检验,方差不齐时采用Dunnett T3检验,P＜0.05表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 大鼠肝组织超微病理改变实验大鼠中,对照组大鼠无死亡,AFB1诱癌模型组7只大鼠死亡,死亡率为46.67% (7/15),2 mg/kg白花丹醌处理组5只大鼠死亡,死亡率为33.33% (5/15),3 mg/kg白花丹醌处理组3只大鼠死亡,死亡率为 20.00% (3/15).对照组大鼠肝组织质地柔软,表面光滑,边缘整齐,肝小叶结构正常,肝细胞索排列规则有序,未见炎性反应、变性和坏死.模型组和处理组大鼠,肝表面可见微小颗粒,或大小不一结节,或肿块,肝细胞核异型性明显,病理检查证实有肝癌发生.

电镜下肝细胞肿胀明显,核体积增大,核膜固缩,异染色质在核膜下聚集,核仁深染(图1A).细胞浆内线粒体数目增多、肿胀,嵴变短、减少,基质密度增加,呈粗颗粒状.粗面内质网增生,呈囊性扩张或成泡状.部分肝细胞内可见线管状滑面内质网增生.糖原颗粒可见.瘤细胞大小不一致,胞核深染、大小不均.核膜曲折内陷或外凸,异染色质丰富,呈粗颗粒状弥漫分布或凝集成块堆集在核膜下.可见巨核、双核,甚至多核,胞核形态不规整,可见怪异核,核仁体积增大,数目增多,形态不规则,靠边(图1B).

图1 大鼠肝组织超微病理.A:肿瘤组织; B肿瘤组织; C:自噬细胞; D:自噬细胞.

3 mg/kg白花丹醌处理组大鼠肝癌组织中多见细胞自噬现象(8例),AFB1诱癌模型2例,2 mg/kg白花丹醌处理组4例.电镜下细胞内大块致密物沉积,核固缩、浓集,细胞器少见(图1B),新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势(图1C).双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体(图1D).

2.2 肝组织中AKT1表达 AKT1 mRNA表达(RT-PCR)结果(图2),AFB1诱癌模型组与对照组比较,大鼠肝组织中AKT1 mRNA 和蛋白表达水平均明显增加,差异有统计学意义(t值分别为17.013、9.986,均P＜0.001); 2 mg/kg白花丹醌处理组与AFB1诱癌模型组,大鼠肝组织中AKT1 mRNA表达明显下降,差异有统计学意义(t=-2.378,P=0.030),蛋白表达水平稍有减少,但差异无统计学意义(t=-1.811,P=0.089); 3 mg/kg白花丹醌处理组与AFB1诱癌模型组,大鼠肝组织中AKT1 mRNA和蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(t值分别为-17.980、-4.247,均P＜0.001)(见表1).免疫组织化学结果显示(图3),AKT1阳性为细胞核染成棕黄色,阴性为细胞核淡蓝色.对照组大鼠肝组织AKT1蛋白在汇管周围少量表达,肝细胞内几乎无表达; AFB1诱癌模型组大鼠肝组织AKT1蛋白在汇管区和部分肝细胞核表达,表达量较对照组明显增加,经白花丹醌处理后,肝组织AKT1蛋白表达量稍有减少,而3 mg/kg白花丹醌处理组表达显著减少.

2.3 肝组织中LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白表达 Western印迹检测肝组织中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白结果(图4),与对照组比较,AFB1诱癌模型组大鼠肝组织中LC3B-II/I比值稍有上升,差异无显著性(t=2.053,P=0.057).与AFB1诱癌模型组比较,2 mg/kg白花丹醌和3 mg/kg白花丹醌处理组大鼠肝组织中LC3B-II/I比值均明显升高,差异有统计学意义(t=2.420,P=0.028;t=35.136,P＜0.001),大鼠肝组织中LC3B-II/I比值在2 mg/kg白花丹醌和3 mg/kg白花丹醌处理组之间的差异有统计学意义(t=21.316,P＜0.001)(表2).

2014年12月，国务院批准了财政部制定的改革方案，确立了政府会计改革的指导思想、基本原则、主要任务、具体内容、配套措施、实施步骤和组织保障。明确提出了此次改革任务：建立健全政府会计核算体系、报告体系。为以后建成我国特色的政府会计准则体系奠定坚实基础。

2.4 肝组织中AKT1 mRNA表达与LC3B-II/I比值的相关性在3 mg/kg白花丹醌处理组大鼠肝细胞癌组织中,其AKT1 mRNA表达与LC3B-II/I比值间存显著负相关(r=-0.611,P=0.035),见图5.

3 讨论

PI3K/AKT/mTOR信号通路在细胞适应生理条件和环境压力过程中,发挥极其重要的负向调节作用,是自噬启动阶段的关键分子,参与肿瘤细胞迁移、黏附、细胞基质的降解[9].活化的AKT可直接磷酸化mTOR的Ser2448位点,激活下游分子mTOR,后者引起自噬蛋白Atg13过磷酸化,使Atg13与Atg1相互作用的亲和力降低,调控与细胞自噬发生相关的多种效应分子的磷酸化,调控自噬蛋白的转录和转位过程.mTOR激酶活性受抑制时,Atg13部分脱磷酸化,诱导自噬的发生[10].自噬是细胞质蛋白和细胞器降解的主要途径,与肿瘤抑制相关,特别是在肝脏[11].

表1 AFB1诱导肝细胞癌模型大鼠肝组织中AKT1 mRNA、蛋白表达(mean±SD)

表2 AFB1诱导肝细胞癌模型大鼠肝组织中LC3-II/I比值的变化(mean±SD)

图2 RT-PCR法测AKT mRNA表达.1:分子量marker; 2:3 mg/kg白花丹醌处理组; 3:对照组; 4:AFB1诱癌模型组; 5:2 mg/kg白花丹醌处理组.

白花丹醌,为一种具有潜在的抗癌活性的萘醌化合物.有研究报道,白花丹醌的提纯物可能通过ERK和PI3K抑制剂,快速诱导自噬活性,显著抑制祼鼠MDAMB-231乳腺癌细胞的生长,具有强有力的广谱抗肿瘤活性[6].Ma等[12]报道,白花丹醌通过活化细胞自噬途径和线粒体介导的凋亡途径,显著抑制AGS胃癌细胞增殖、抑制细胞浸润和迁移.Lin等[13]报道,白花丹醌以剂量和时间依赖方式,抑制人肝癌SMMC-7721细胞株的细胞增殖,SMMC-7721 细胞内有自噬体形成和LC3 蛋白表达,有效抑制祼鼠移植瘤的生长,诱导细胞凋亡、自噬.我们的实验电镜结果显示,白花丹醌处理组大鼠肝癌组织中多见细胞自噬现象.与AFB1诱癌模型组比较,2 mg/kg白花丹醌和3 mg/kg白花丹醌处理组大鼠肝组织中LC3B-II/I比值均明显升高,以3 mg/kg白花丹醌处理组更显著.结合电镜结果,我们发现,白花丹醌可显著增加AFB1诱导型大鼠肝癌细胞自噬活性.

图3 各组实验大鼠肝组织AKT 1免疫组织化学染色(DAB显色).A:对照组; B:AFB1诱癌模型组; C:2 mg/kg白花丹醌处理组; D:3 mg/kg白花丹醌处理组(A、B放大100倍,C、D放大200倍).DAB:二氨基联苯胺.

图4 Western blot法测肝组织中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白表达.1:对照组; 2:3 mg/kg白花丹醌处理组; 3:2 mg/kg白花丹醌处理组; 4:AFB1诱癌模型组.

图5 3 mg/kg白花丹醌处理组肝细胞癌组织中AKT1 mRNA表达与LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值间相关性分析.

白花丹醌具有抗肿瘤作用,但其抗癌机制尚未阐明.Xue等[14]报道,白花丹醌可能通过抑制AKT/mTOR信号通路,增加细胞内活性氧物质的含量,提高顺铂对CAL27细胞、顺铂耐受的CAL27/CDDP细胞的细胞毒性、凋亡和自噬作用,抑制舌鳞状细胞癌发生和进展.我们的实验结果显示,AFB1诱癌模型组大鼠肝组织中AKT1 mRNA和蛋白表达水平均明显增加,应用3 mg/kg白花丹醌预处理后,大鼠肝组织中AKT1 mRNA和蛋白表达明显下降.这些证据表明,白花丹醌能有效抑制AFB1诱导性大鼠肝细胞癌组织中AKT1表达,这证实了白花丹醌可能通过抑制AKT/mTOR信号通路,发挥抗肝脏肿瘤作用.

有部分研究报道了自噬与肿瘤进展的关系,但HCC肿瘤组织中AKT表达与自噬活性之间相关性的研究,目前少有报道.我们的研究结果显示,AFB1诱导型大鼠肝细胞癌组织中,AKT1 mRNA表达与LC3B-II/I比值存在显著负相关(P=0.035).我们推测HCC组织中自噬活性的增加,可能抑制AKT的表达.

综上所述,我们发现AFB1诱导HCC模型大鼠肝组织中,AKT1表达明显升高,应用白花丹醌可显著抑制AKT1表达,使肝肿瘤组织中自噬活性增加,且AKT1表达与自噬活性之间存在显著负相关.因此,我们推测白花丹醌可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制AFB1诱导型大鼠肝细胞癌组织中AKT1的表达,增加肝癌细胞自噬活性,从而发挥抗肝脏肿瘤的作用.然而,白花丹醌药理活性广泛,对组织氧环境、细胞内氧压力的改变,也有可能改变细胞自噬活性,除PI3K/AKT/mTOR信号通路外,且存在多种影响细胞自噬活性的信号传导途径.因此,白花丹醌抗肿瘤的机制有待进一步研究.

实验背景

自噬在调节肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的进展中起重要作用.白花丹醌具有抗肿瘤作用,但抗癌机制未明确.本研究采用白花丹醌干预黄曲霉毒素B1 (aflatoxin B1,AFB1)诱导型大鼠HCC细胞,探究其对HCC自噬活性影响及潜在机制.

实验动机

白花丹醌是天然的植物化学物质,探究其对HCC自噬活性的影响及潜在机制,对药物的临床应用具有积极意义.

实验目标

探究白花丹醌对大鼠HCC自噬活性影响,并初步探究其潜在机制.

实验方法

制作大鼠HCC模型并用白花丹醌干预,透射电镜观察肝组织和自噬细胞的超微结构.RT-PCR和免疫组织化学染色技术测AKT1 mRNA和蛋白的表达.Western Blot测肝组织中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白表达.比较各组间AKT1 mRNA和蛋白表达差异,及LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值差异.

实验结果

白花丹醌可显著增加AFB1诱导型大鼠HCC细胞自噬活性.AFB1诱癌模型组大鼠肝组织中AKT1 mRNA 和蛋白表达水平均明显增加,应用3 mg/kg白花丹醌预处理后,大鼠肝组织中AKT1 mRNA和蛋白表达明显下降.

实验结论

白花丹醌可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制AFB1诱导型大鼠HCC组织中AKT1的表达,增加HCC细胞自噬活性,从而发挥抗HCC的作用.