强还原土壤灭菌法改良研究

于双 邹洪涛 杜志德 叶旭红

摘要    強还原土壤灭菌法是一种广谱性、高效性和环境友好性的作物种植之前的土壤消毒方法。为提高RSD的杀菌效果，本文以丛枝菌根菌、降解菌、蚯蚓粪为添加物研究其对已添加苜蓿秸秆的RSD的影响。结果表明，丛枝菌根菌、降解菌、蚯蚓粪的添加显著提高了土壤pH值，降低了土壤NH4+、NO3-、SO42-含量。主成分分析得出各处理效果为FAJ>ACJ>FAA>FA>FAY>CK2>CK1。本研究典范对应分析结果表明，土壤SO42-是驱动尖孢镰刀菌减少的主要因子。降解菌与苜蓿秸秆配施处理对尖孢镰刀菌的杀灭效果最佳，明显提高了防治效果，降低了番茄枯萎病的发病率，具有推广的潜力。

关键词    强还原土壤灭菌法;番茄枯萎病;AMF;降解菌;蚯蚓粪;主成分分析法

中图分类号    S154.3        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）12-0120-05                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Study  on  Improvement  of  Reductive  Soil  Disinfestation

YU Shuang 1，2，3    ZOU Hong-tao 1，2，3    DU Zhi-de 1，2，3    YE Xu-hong 1，2，3 *

（1 College of Land and Environment，Shenyang Agricultural University， Shenyang Liaoning 110866; 2 Northeast Key Laboratory of Conservation and Improvement of Cultivated Land，Ministry of Agriculture; 3 National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources）

Abstract    Reductive soil disinfestation （RSD）  is a broad-spectrum， efficient and environment-friendly soil disinfection method before planting crops.In order to improve the bactericidal effect of RSD， the effects of arbuscular mycorrhiza fungi，degrading bacteria and vermicompost on RSD added with alfalfa straws were studied in this paper. The results showed that the addition of arbuscular mycorrhiza fungi， degrading bacteria and vermicompost significantly increased soil pH and decreased the contents of NH4+， NO3- and SO42- in soil. Principal component analysis showed that the effect of each treatment was as follows： FAJ>ACJ>FAA>FA>FAY>CK2>CK1. The results of canonical correspondence analysis showed that soil SO42- was the main factor driving the decrease of Fusarium oxysporum f. sp.lycopersicisnyderetet Hansen.The combined application of degraded bacteria and alfalfa straws had the best killing effect on  F. oxysporum， significantly improved the control effect， reduced the incidence of tomato wilt， and had the potential to be popularized.

Key words    reductive soil disinfestation; tomato wilt; arbuscular mycorrhiza fungi; degrading bacteria; vermicompost; principal component analysis

番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxy-sporum f. sp. lycopersicisnyderetet Hansen）侵染番茄引起的一种世界性的土传真菌病害。病菌从植物根部侵入，扩展进入维管束，阻塞根部向上输送水分和营养物质的通道，致使植株因缺乏水分和营养而死亡，是威胁番茄产量和品质的主要病害之一[1]。当前，滥用化肥、农药严重损害人类健康，因而针对病虫害的绿色防控技术越来越受到重视[2-3]。例如，适量添加蚯蚓粪可以提高土壤放线菌/真菌比值[4]，抑制土壤中植物病原菌的生长[5]，在治理西瓜连作障碍方面，添加蚯蚓粪可使植物死亡率仅为27.5%和22.5%[6];此外，为作物接种丛植菌根真菌（arbuscular mycorrhiza fungi，AMF），不仅能改善植物对矿质营养的吸收、增强植物抗旱性，在防治土传病害[7-8]和调节土壤结构[9-10]等方面也具有重要作用。很多研究证明，强还原土壤灭菌法（reductive soil disinfestation，RSD）在土传病害的治理方面具有广谱性、高效性和环境友好性，已在美国和日本等国取代化肥、农药，广泛应用于土传病害治理中[11]。

强还原土壤灭菌法是一种操作简单、处理时间短、不耽误农时的作物种植前的土壤处理方法[12]，厌氧降解过程中产生的有毒物质可有效杀灭土传病原菌[13-14]，且恢复有氧条件后这些物质可被再次氧化，从而不对土壤造成二次毒害[15]。现有研究表明，添加玉米秸秆使尖孢镰刀菌的数量仅为处理前土壤中的2.88%[16]，但落干后尖孢镰刀菌易复发的问题较严重。之前的研究也表明，在RSD中玉米秸秆配施蚯蚓粪和FMF明显提高了单施玉米秸秆对尖孢镰刀菌的灭菌效果，改善了土壤理化性质;此外，降解菌的加入也使FOC含量降低了99.0%，且在落干期间仍持续杀灭97.0%的病原菌，灭菌效果显著但仍未彻底消灭;另一方面，研究者们以苜蓿为改良剂延长了对镰刀菌的抑制时间[17-18]，将尖孢镰刀菌数量降低了98.0%[19-20]，但是目前RSD处理各改进方法仅能抑制或降低尖孢镰刀菌的数量而不能根除，由于微生物繁殖的特性，恢复适宜条件后仍可继续大量繁殖[21]。因此，致力于探索彻底根除土壤中尖孢镰刀菌的方法，是治理番茄枯萎病进程中亟待解决的关键问题。

玉米秸秆和苜蓿秸秆是目前RSD法中的重要有机物料。之前的研究表明，蚯蚓粪、AMF、降解菌配施玉米在治理土传病害方面效果显著。因此，本研究旨在进一步探讨用AMF、蚯蚓粪、降解菌改良苜蓿秸秆对尖孢镰刀菌的灭菌效果，并进行各指标的分析，进一步优选RSD法抑制尖孢镰刀菌的有机物种类，提高对番茄枯萎病的治理效果，以期为枯萎病防治提供理论支持，并为进一步强化RSD法、增强防控效果提供应用基础和技术支撑。

1    材料与方法

1.1    试验材料

试验土壤是番茄—小白菜轮作15年的大棚土（辽宁省沈阳市苏家屯区宋大台村），该地土壤自2010年以来由尖孢镰刀菌引起的土传病害严重，发病率高达60.0%～70.0%。取土 300 kg，随机选取0～20 cm土层的土样。该土壤的pH值为5.29，Eh值为408.60 mV，含全碳4.04%、全氮0.47%、铵态氮31.41 mg/kg、硝态氮297.70 mg/kg、硫酸根890.85 g/kg。供试有机物料玉米秸秆、紫花苜蓿秸秆、蚯蚓粪分别在沈阳农业大学后山实验基地获得，充分晒干后分别测定其理化性质。苜蓿秸秆含全碳43.05%、全氮5.04%，C/N为8.54;蚯蚓粪含全碳13.71%、全氮1.30%，C/N为10.55;玉米秸秆含全碳40.50%、全氮1.10%，C/N为36.92。供试秸秆降解菌来自沈阳农业大学土壤改良与农业节水课题组，AMF来自南京土壤研究所。

1.2    试验方法

盆栽试验设7个处理，即不淹水不添加有机物料（CK1）、淹水不添加有機物料（CK2）、淹水+2.0%玉米秸秆（均为质量分数）[16]+200 mL降解菌（3.58×108个/mL）（FCJ）、淹水+1.0%苜蓿[20]（FA）、淹水+苜蓿+0.1% AMF[22]（FAA）、淹水+苜蓿+降解菌（FAJ）、淹水+苜蓿+20%蚓粪[23]（FAY），3次重复。由于添加的有机物不同，而试验要求每个处理的总氮量相同，因而差额氮素用尿素（含纯N 46.4%）补平，其余肥料正常处理。

于沈阳农业大学后山温室大棚内进行盆栽试验，用直径30 cm、高70 cm且底部有排水孔的桶，先将排水孔堵住，取土过5 cm筛，每桶分装10 kg土，不同处理加入不同有机物料等，混匀，将桶随机排列。除CK1外，其他处理均淹水没过土5 cm，保鲜膜封口。25～40 ℃处理15 d，分别于处理第0、5、10、15天用聚乙烯自封袋采土（去除盆栽的表层土），放入冰盒带回实验室，一部分测土壤细菌、真菌、尖孢镰刀菌菌落数，一部分土样-20 ℃冷冻保存，测定土壤pH值及NH4+、NO3-、SO42-含量以及土壤酶活。最后一次取样后，去掉顶部保鲜膜，打开桶底部的排水孔，土壤自然落干至田间持水量后，移栽形态和长势基本一致的番茄1株，进行正常的水肥管理，观察植株发病率。

1.3    测定指标及方法

1.3.1    微生物测定方法。计数方法采用稀释平板法[24]，28 ℃恒温培养，细菌培养2 d后计数，真菌、尖孢镰刀菌培养4 d后计数。用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基[25]测定土壤细菌数量。用PDA培养基[26]测定土壤真菌数量。用改良的K2培养基[27]测定土壤尖孢镰刀菌数量。

1.3.2    土壤理化分析。土壤pH值（水土比5∶1）采用DMP-2 pH计（Quark Ltd，China）测定，Eh值采用DMP-2 mV计（Qu-ark Ltd，China）直接测定，土壤及有机物的初始全氮、全氮含量采用元素分析仪测定，SO42-含量（水土比5∶1）采用硫酸钡比色法测定，NH4+-N和NO3--N含量采用San++连续流动分析仪（Skalar，Breda，Netherlands）测定。

1.3.3    土壤酶活性测定。土壤脲酶取10 g过1 mm筛的风干土，土壤过氧化氢酶取5 g过1 mm筛的风干土，按《土壤微生物研究原理与方法》中的方法测定。脲酶以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚一次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来测定脲酶活性，以24 h后1 g风干土产生的NH4+-N的毫克数表示;过氧化氢酶活性用H2O2为基质，充分酶促反应后，用KMnO4溶液滴定剩余过氧化氢量，以单位土重消耗0.1 mol/L KMnO4的体积（mL）表示。

1.3.4    发病率评定标准。1级，无病斑;2级，病斑面积占整个叶面的0～5.0%;3级，病斑面积占整个叶面的6.0%～25.0%;4级，病斑面积占整个叶面的26.0%～50.0%;5级，病斑面积占整个叶面的50%以上。计算公式如下：

发病率（%）=发病株数/试验总株数×100;

防治效果（%）=（1-发病率）×100。

1.4    数据处理

采用Excel 2007和SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。采用单因素（one-way ANOVA）和Duncan法进行方差分析和多重比较（α=0.05）。利用Canoco 5、Heml 1.0.3.7、Origin 2018软件作图。图、表中数据为平均值±标准差。

2    结果与分析

2.1    土壤理化性质的影响

2.1.1    土壤pH值、Eh值的变化。由图1（a）可以看出，处理第5天，所有淹水处理的土壤pH值均显著上升，在淹水后期达到7.0左右。落干后添加蚯蚓粪处理的土壤pH值（5.7）显著高于CK1、CK2，其余处理土壤pH值均在5.0～5.3之间。由图1（b）可以看出，淹水处理可显著降低土壤Eh值，添加降解菌的处理比其他处理更能影响土壤Eh值，可能是由于降解菌分解苜蓿秸秆消耗大量氧气导致的，落干后土壤 Eh值均比处理前土壤Eh值高，可能与落干时间过长有关。

2.1.2    对土壤NO3-、NH4+和SO42-的影响。由图1（c）可以看出，所有淹水处理中土壤的NO3-浓度在处理第5天均显著下降了96.0%～98.0%（CK1：297.70 mg/kg），随时间增加差异不显著。处理FA、FAJ在第5天的NO3-浓度降到最低，分别为8.11、5.73 mg/kg;处理FCJ在第15天的NO3-浓度降到最低（6.63 mg/kg）。由图1（d）可以看出，与NO3-浓度的变化趋势相反，除处理FAY外，土壤NH4+浓度在处理第5天均呈上升趋势（CK1：31.41 mg/kg），处理FCJ在淹水第10天升到最高，土壤NH4+浓度为80.31 mg/kg，其余处理均在第15天升至最高，落干后所有淹水处理土壤NH4+浓度均回升至处理前水平。由图1（e）可以看出，所有的淹水处理中土壤的SO42-浓度均呈先下降后上升再下降的趋势，其中处理FAY在淹水第 5天降至22.45 g/kg（CK1：890.85 g/kg），随淹水时间的增长SO42-浓度在第10天达到最高，然后降低，土壤落干后又呈增加的趋势，但与处理前相比差异仍显著。

2.1.3    土壤微生物量的变化。由图1（f）（g）（h）可以看出，在所有的淹水处理中土壤细菌、真菌比处理前增多，数量均在6.0～8.2 lg（CFU/g）之间。与细菌、真菌数量变化趋势相反，淹水处理显著降低了土壤FOC数量，且随着处理时间的增加处理土壤中FOC的数量呈下降趋势，在淹水第15天较CK1[5.16 lg（CFU/g）]显著降低了99.0%，其中处理FAA、FAJ的FOC数量[1.27、1.07 lg（CFU/g）]降低了99.9%。土壤落干后，处理CK2与淹水15 d相比，增加了97.0%，处理FAA的FOC数量增加了83.0%。與淹水15 d相比，处理FCJ、FAJ以及 FAY又分别降低了98.1%、13.6%、83.1%，仅为处理前土壤中 FOC数量的0.1%。

2.2    土壤理化性质的综合分析

2.2.1    土壤微生物数量与理化指标及酶活的相关性分析。为了进一步了解各处理土壤微生物数量与理化指标及土壤酶活性之间的相互关系，对3种微生物数量与5种理化指标及2种酶活性进行相关性分析。从表1可以看出，除过氧化氢酶与NH4+为显著相关（P<0.05）外，其余指标均表现出极显著相关性（P<0.01）;可培养细菌数和真菌数与各指标相关性相同，均与土壤pH值、NH4+、过氧化氢酶成极显著正相关关系（P<0.01），与Eh、NO3-、SO42-、脲酶成极显著负相关关系（P<0.01）;与细菌、真菌数相反，土壤尖孢镰刀菌数与土壤pH值、NH4+、过氧化氢酶成极显著负相关关系（P<0.01），与Eh、NO3-、SO42-、脲酶成极显著正相关关系（P<0.01）。

2.2.2    土壤微生物数量与理化指标及酶活的综合分析。主成分分析（principal component analysis，PCA）可将原来众多具有一定相关性的数据降维生成互相无关的少量几个新的综合指标来代替原来的指标用于综合分析的方法，是现代多元数据分析的标准工具[28]，可避免指标间的多重共线性问题[29]。利用SPSS对7个处理下的5个时期的10个性状进行数据标准化后，对其进行主成分分析，结果如表2所示。由表2可知，第1主成分特征值为7.120，贡献率为71.204%;第2主成分特征值为1.084，贡献率为10.835%，前2个主成分的累积贡献率达82.039%，且2个主成分的特征值均>1，能够有效解释原始变量的基本信息，达到了降维的目的，符合主成分分析的要求。因此，可以采用前2个主成分代替上述10个性状对不同处理在5个时期中的表现进行综合分析。

主成分分析展示了不同处理方式下，解释方差占总方差的71.2%和10.8%，淹水对 NO3-、NH4+、SO42-影响显著。其中主成分1与NH4+、真菌数成高度正相关，与NO3-、SO42-成高度负相关，主成分2与细菌数、FOC成高度正相关，与Eh、过氧化氢酶成高度负相关。因此，2个主成分可以综合表现淹水效果。以主成分1为横轴，主成分2为纵轴建立坐标系，横轴数值越大表示土壤理化性质及微生物活性越好，反之则表示土壤性质越差，纵轴数值越大表示土壤尖孢镰刀菌数越多。由图2可看出，CK1样品的横轴和纵轴数值皆最大，表明第0天土壤尖孢镰刀菌数最多，随着横轴及纵轴的减小，各样处理土壤尖孢镰刀菌数逐渐下降，从总体来看处理效果为FAJ>ACJ>FAA>FA>FAY>CK2>CK1。

典范对应分析（canonical correspondence analysis，CCA）可以有效揭示环境因子对物种因子的数量关系。土壤中pH值、Eh、NO3-、NH4+、SO42-的浓度作为与土壤细菌数、真菌数、尖孢镰刀菌数显著相关的重要指标，它们能够很好地反映土壤质量的变化情况，但上述研究结果并不能直观地反映出土壤中 pH值、Eh、NO3-、NH4+、SO42-的浓度与土壤微生物群落之间的数量关系。因此，本研究应用典范对应分析法，将土壤中pH值、Eh、NO3-、NH4+、SO42-的浓度作为环境变量，对不同淹水处理下的土壤微生物群落之间的关系进行了深入的典范对应分析。如图3、4所示，调整后的方差解释度为71.7%，SO42-对物种的影响具有显著性，SO42-对微生物变化的解释度为69.5%，可以认为是驱动土壤微生物变化的主要因子。

2.3    枯萎病防治效果

种植番茄90 d后对番茄发病状况进行调查，结果如图5所示，可以看出，CK1番茄枯萎病的防治效果为6.7%，而强还原土壤灭菌法处理过后番茄枯萎病的防治效果明显上升，处理FAY的防效为67.0%，处理FAJ的防效为77.6%，处理FAA的防效达到了86.7%，无一盆栽死亡。

3    结论与讨论

番茄枯萎病是大棚保护地严重损害产量的土传病害，在传统的生物防控措施中，由于实际环境的多变性，使功能微生物在接种进入土壤后难以稳定发挥作用，防控效果较差。虽然强还原措施自身具有一定的复杂性，但前期大量的田间试验表明，只要严格控制条件，其效果是有效且稳定的，不因土壤类型、作物种类的变化而明显变化[30]。

相关分析表明，强还原条件下不同有机物组合处理的土壤性质间存在着显著或极显著的相关性，即各因素间传递的信息有一定的重叠性，利用单个因素不能对其进行准确的分析。主成分分析是利用降维的思想，从原始指标中提取出更少的几个不相关的新指标，可用于解释原始指标里所包含的信息[31-32]，使结果更客观、可靠[33]。本研究通过主成分分析，将7个处理的10个性状简化为2个彼此不相关的综合指标，且其累计方差贡献率达82.0%，并依据这2个主成分建立了PCA图，从图中得出各处理效果为FAJ>ACJ>FAA>FA>FAY>CK2>CK1。

分析强还原灭菌法修复番茄枯萎病土壤的原因，可能有以下几点。一是提高了土壤pH值。淹水添加有机物料创造土壤强还原条件，土壤孔隙度减少，CO2等酸性气体被排出，积累在土壤中的金属离子、硝态氮被还原，降低了土壤盐分含量，该还原过程需要消耗H+;与典范对应分析中FOC与土壤pH值成显著负相关的结果一致。二是对病原菌有毒的物质的生成。强还原条件可将SO42-等还原成H2S、氨等物质，添加的有机物质在缺氧或厌氧环境下发酵生成乙酸、丙酸、丁酸等，这些有机酸对土传病原菌有杀灭作用，与本文典范对应分析中FOC与SO42-成正相关关系的结论相同，而且强还原处理可有效降低SO42-含量[34]，SO42-是驱动尖孢镰刀菌减少的主要因子。

从防治效果来看，AMF更能防治番茄枯萎病的发病率，这可能与AMF的“根系—根际—植株三级防御”理论有关，其中根系防御主要包括AM真菌與病原物竞争生态位和构建机械防御屏障，根际防御主要包括调节根系分泌物与次生代谢产物及与拮抗菌协同抗病，从而抑制病原物生长及侵染发病[35]。

在用RSD法治理番茄枯萎病的盆栽试验中，土壤中的SO42-和NH4+含量可明显影响土壤尖孢镰刀菌数量;添加降解菌和丛植菌根的处理能最大限度地改善土壤酸碱性，显著提高酸性土壤pH值。结果表明，降解菌与苜蓿秸秆配施处理对尖孢镰刀菌的杀灭效果最佳，明显提高了防治效果，降低了番茄枯萎病的发病率，具有推广的潜力。

4    参考文献

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