苹果矮化砧木组织培养的主要影响因素和问题分析

黄立华

摘要    本文以苹果矮化砧木为对象，简要综述了其研究进展和在组织培养过程中的主要影响因素，并对组织培养过程中存在的问题进行了阐述，以期为苹果矮化砧木快繁提供借鉴。

关键词    苹果矮化砧木;组培快繁;影响因素;问题

中图分类号    S661.1        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）12-0114-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

苹果矮化密植栽植已成为当今世界苹果产业发展和研究的主流，而其主要方式是利用矮化砧木[1-3]。当前生产上主要有矮化中间砧和自根砧2种类型，通过对比发现，后者拥有整齐度高、早果性、产量高、品质好等諸多优势[2];生产上后者的繁殖方式主要有压条、扦插和组织培养等3种，与前2种繁殖方式对比发现，组织培养拥有繁殖系数大、周期较短、不受季节约束、苗整齐度高以及节省育苗用地等优点[3-5]。因此，本文以矮化苹果自根砧为研究对象，介绍其组织培养研究进展，以及主要影响因素和培养过程中存在的问题，以期为生产上苹果矮化自根砧的快繁提供理论依据。

1    苹果矮化自根砧的组培研究进展

在20世纪60年代，研究者通过矮化自根砧的茎尖进行组织培养，得到了其再生植株，在20世纪80年代，组织培养在苹果砧木快繁上得到了较快的发展[4-5]。

我国苹果砧木组培快繁的研究工作起源于20世纪70年代，于1977年通过利用M7和M9 2种苹果砧木的新梢作为研究材料，对枝段的茎尖进行离体培养，突破性地获得了移栽的组培苗[3-5];而快速发展阶段是在80年代中后期[5-6];目前，多数品种和砧木的器官已经能够进行工厂化育苗。苹果矮化自根砧繁殖主要采用组织培养快速繁殖，虽然此种方式对技术要求较高，但其诸多优点使其在苹果矮化自根砧的快速返回和无病毒苗培育上有较为广泛的应用[3-5]。

2    苹果矮化自根砧组培的主要影响因素

2.1    基因型

基因型不同是较主要的影响因素。研究发现，相同品种在不同的培养基中培养，最终表现不同;不同品种在相同培养条件下表现也不同。因此，需要对不同苹果砧木类型的组培快繁进行深入系统的研究[7]。通过对奥查金、美铃、新红星苹果进行研究发现，其生长分化的情况有显著差异，首先从分化指数可以看出差别;此外，瓶内材料的长势情况差异较大，从优到差依次为奥查金>美铃>新红星[8]。

2.2    基本培养基

研究表明，MS培养基（附加琼脂+蔗糖，浓度分别为6 g/L和30 g/L）为较多苹果砧木组织培养常用的基质[4];另外有研究发现，GM256和M26砧木材料在增殖生长过程中，最佳的基质为QL[9-10];师校欣等发现，首红试管苗采用的是改良的C17作为基本培养基[11]。

2.3    植物生长调节剂

植物生长调节剂主要有细胞分裂素、生长素和赤霉素等[4，12]，其中细胞分裂素和生长素是在组织培养诱导和继代过程中发挥作用的调节剂[12]。

研究发现，细胞分裂素是在细胞分裂、不定芽分化和茎的分化等过程中起作用的[12-13]，而当培养基中添加此种调节剂，可以起到推动细胞的分裂、器官或愈伤组织可以产生不定芽[12];此外，此种调节剂还能够抑制顶端优势，从而使腋芽萌发，因而也可以用于增殖[12];在苹果矮化砧木组织培养进程中用到的此类调节剂常常有玉米素、6-苄基腺嘌呤和激动素（分别为ZT、6-BA和KT）等一类嘌呤的衍生物[12-13]。

生长素在苹果矮化砧木组织培养过程中的功能是促使外植体进行脱分化以及促进细胞开始分裂生长，另外还起到对根的分化进行诱导的功能[4]。研究和生产上经常使用的此类调节剂有IBA、NAA、IAA，它们的活性强弱顺序为NAA>IBA>IAA[12]。

研究表明，在苹果矮化砧木离体的茎尖顶端分生组织中，生长激素不能自我产生，需人为提供细胞分裂素和生长素，其主要作用是促使茎尖的生长分化[14]。研究发现，2种激素对细胞生长分化具有协同作用，其不同配比和不同量对细胞分化产生的调节作用不同[14]。另外，继代培养成功的重要因素是激素的类型和质量浓度[7];研究发现，培养基中调节剂的种类、浓度以及不同的组合能够使组织、器官的发育和分化方向有差异[15]。前人研究发现，苹果矮化砧木使芽分化诱导的最佳调节剂为6-BA，浓度为0.5～2.0 mg/L;继代和增殖培养时，最佳的调节剂为6-BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L;生根培养时，最佳调节剂为IAA 1.0～1.5 mg/L [16-17]。此外，对苹果砧木组培快繁研究发现，品种和研究者的不同导致激素类型和浓度有所差异，对于相同的苹果砧木而言，研究者的不同使研究的结论也不尽相同[9，12，18-22]。

2.4    培养条件

在苹果矮化砧木组培快繁中，培养条件的影响因素有多种，其中主要影响因素为光照和温湿度[4，12，23]。研究发现，通常情况下，培养室的光照时间、光照强度分别为12～16 h/d、1 000～5 000 lx[4，23];另外，黑暗条件可以使细胞和愈伤组织的增殖效果显著，但器官分化则需要适宜的光照[12，23]。研究发现，当温湿度过高和过低时，都不利于植物的生长，在苹果矮化砧木组培快繁中要求的温度为25 ℃左右，湿度保持为70%～80%[4-5]。此外，高温高湿可能导致试管苗玻璃化[4]。

3    褐化及玻璃化问题

3.1    褐化问题

苹果矮化自根砧外植体褐化是影响其组培快繁的主要因素，组培一般采用HgCl2和乙醇配合的方法灭菌，以达到无菌的状态，在此过程中易出现严重的褐化现象[4-5]。

研究表明，褐化的产生与品种、取材时间、消毒时间、激素水平、取材部位、培养基成分、培养条件以及外植体的年龄和大小等都有一定关系[4，12-13]。研究发现，基因型是褐变产生的最关键原因[4];木本植物体内酚类物质处于高水平时，褐化几率较大;外植体树龄大，其木质素含量高，易褐化;外植体较小时，也易褐化[12];此外，处于生长季节的外植体中含有较多的多酚氧化物，也较易发生褐化[4]。木质化程度和代谢活动不同的外植体，其褐化程度也不同;高温、高浓度的细胞分裂素或无机盐也易导致褐化[4，24]。

因为褐化对苹果矮化砧木组培快繁影响较大，所以相应的防止研究较多。研究表明，低温可以抑制酚类物质氧化，从而降低多酚氧化酶活性，进而降低外植体的褐化率[4-5];梁海永等对阿月浑子采用暗培养后光培养以减轻褐化[25];选择适宜的取材时间[4]、取材部位[26]及取较大外植体[24]也有利于抑制褐化。研究发现，核桃在春秋季取材较夏季取材褐化减轻[24];10年以上成年树侧芽易发生褐化，而1～3年实生苗则褐化发生较迟[26];加入Na2S2O3的培养基能够减少核桃外植体产生褐化现象[27]。此外，添加褐化抑制剂（如抗坏血酸、半胱甘肽、乙二酸四乙酸等[26]）或吸附剂（活性炭、聚乙烯吡咯烷酮）能够抑制酚类进行氧化，进而减轻褐化的产生[26]。

3.2    玻璃化

此种问题的苹果矮化砧木组培苗呈现的形态是半透明状和外观异常[4-5]，表现为叶片皱缩和卷曲、脆弱易破碎、颜色不正、分化能力低、移栽成活率低等[3-5]。因此，苹果矮化自根砧组培中的玻璃化现象为其快繁过程中的又一难题。

导致苹果矮化自根砧组培苗玻璃化的原因有很多，其中基因型是导致其发生的主要原因;其次直接导致其发生的原因有环境湿度、外植体的类型和高的培养基水势;再有能够导致其发生的原因有培养基中不适宜的碳源、无机盐或离子;还有就是6-BA可以致使玻璃化的产生[2-4]，通过对M7苹果砧木和富士苹果研究发现，基质中6-苄基腺嘌呤浓度高则玻璃化率就高，当浓度为0.5 mg/L和1.5 mg/L时，所发生的比例分别为10%和50%[28];此外，培养条件的不适合，也是产生玻璃化苗的原因[3-5]。

对于组培快繁中防止玻璃化的产生，也有较深的研究。当外植体类型选择合适时，玻璃化率就会大幅降低，通过对瑞香不同外植体类型进行研究发现，其中部茎段玻璃化率高达100%，而其基部和茎尖则较低[29]。调整培养基中碳源、无机盐或离子也能够在一定程度上使玻璃化的发生几率降低。张翠玉等[30]对月季玻璃化率研究发现，当培养基中缺少或减少硝酸铵时，其发生率显著降低;当盐的浓度适宜时，能够使玻璃化的产生几率降低;另外，K+或Ca2+也能够降低玻璃化的发生几率[31]。针对植物生长调节剂尤其是6-BA易导致玻璃化发生的原因，研究发现，可降低其浓度来防止或减轻玻璃化的产生[28]。研究还发现，当琼脂的浓度提高时，玻璃化的产生几率也会降低[32];水分胁迫剂（PVA）的加入也能够使玻璃化的产生几率降低[28]。

4    参考文献

[1] 王婷婷，胡春宏，常蘋，等.苹果矮化砧木品种Bud9组织培养技术研究[J].农业与技术，2019，39（19）：27-29.

[2] 周莉.苹果矮化砧木离体培养和快繁体系建立与优化[D].杨凌：西北农林科技大学，2017.

[3] 赵勤，张贞，徐金.目前国内苹果矮化出现的问题与对策[J].林业科技通讯，2016（6）：17-19.

[4] 王淼淼.几种新型苹果矮化砧木的组培快繁技术研究[D].保定：河北农业大学，2015.

[5] 杨艳敏，魏永祥，刘成，等.苹果矮化砧木组织培养及脱病毒技术[J].北方园艺，2016（4）：107-112.

[6] 韩静.几种无性繁殖方式对苹果砧木生根的影响[D].杨凌：西北农林科技大学，2015.

[7] 杜学梅，李登.植物生长调节剂在苹果组培上的应用[J].中国农学通报，2002（4）：75-79.

[8] 师校欣，高仪，马宝昆，等.苹果茎尖培养中无菌繁殖系建立的研究[J].河北农业大学学报，1997（2）：45-49.

[9] 孙清荣，孙洪雁，李林光，等.苹果矮化砧GM256高效快繁技术体系的建立[J].中国农学通报，2014，30（7）：95-99.

[10] 孙清荣，关秋竹，王海波，等.苹果抗寒矮化砧木‘BP-176的组织培养及其叶片不定梢诱导[J].果树学报，2019，36（6）：812-818.

[11] 师校欣，高仪，马宝焜.“首红”苹果茎尖培养及快速繁殖[J].植物生理学通迅，1996（6）：42.