溶剂萃取分离-高效液相色谱-串联质谱法测定对虾中12种抗生素的残留量

李飞鹏，黄 炯，王明珠，陈 玲∗，陶 红

(1.上海理工大学 环境与建筑学院，上海 200093；2.同济大学 环境科学与工程学院，上海 200092)

随着人们对水产品消费需求的增加，对虾等水产品的养殖面积和养殖密度不断增加。然而，在大规模集约化养殖中，细菌性虾病频繁发生，抗生素作为防治细菌性疾病的药物被广泛应用。残留在水产品中的抗生素，经过食物链的富集作用，会严重威胁人体的健康[1]。磺胺类、喹诺酮类、四环素类等多种抗生素在不同水产品中不断被检出，部分水产品中抗生素的检出量远超过我国规定的最大残留限量[2-5]。抗生素类药物进入水产动物体内，经过吸收、代谢和排泄过程后，其残留量一般在μg·L－1水平，但是由于水产品中含有蛋白质、脂类、色素和水分等物质，基质十分复杂，其中任何一种基质成分的含量都可能是药物残留组分的数百倍以上，不仅会干扰目标物的检测准确度，还会污染仪器设备，降低仪器灵敏度和使用寿命[6]。因此，选择有效的前处理方法和高灵敏度的检测方法，是分析此类样品的关键性步骤。

加速溶剂萃取法[7]、加压液相萃取[8]、酶联免疫法[9]等常见的预处理方法多用于提取水产品中的一类或两类抗生素，水产品中多种类型抗生素同时检测的报道尚不多见[10-12]。超声溶剂萃取法被认为是有效、直接的一种提取方法，具有提取效果好、省时、操作简单等优点[13-15]，因此本工作选用超声溶剂萃取法提取目标物，并对其条件进行优化改进，然后采用高效液相色谱-串联质谱法测定南美白对虾样品中的5 种磺胺类抗生素及增效剂[磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲恶唑(SMD)、磺胺二甲基嘧啶(SMZ)、磺胺对甲氧嘧啶(SMX)和甲氧苄胺嘧啶(TMP)]、2种喹诺酮类抗生素[诺氟沙星(NOF)和左氧氟沙星(LEOF)]、3种四环素类抗生素[土霉素(OTC)、四环素(TC)和金霉素(CTC)]以及2种大环内酯类抗生素[红霉素(ETM)和罗红霉素(RTM)]，旨在建立一种成本低、适用性广且能同时检测水产品中多种抗生素的分析方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Access MAX 型高效液相色谱-串联质谱仪；TDL-5-A 型大容量离心机；Hei-VAP Advantage型旋转蒸发仪；KQ 2200B型超声波清洗器；美国SULPELCO SPE-12型固相萃取装置(内置12管)；MTN-2800D 型氮吹仪；Scientz-12N 型冷冻干燥机；TL-2010型球磨机。

12种抗生素的标准储备溶液:500 mg·L－1，介质为甲醇。

混合标准溶液:1 mg·L－1，介质为甲醇。

混合标准溶液系列:介质为甲醇，质量浓度分别为1，2，5，10，20，50，100μg·L－1。

含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液:称取11.8 g一水合柠檬酸、13.72 g十二水合磷酸氢二钠、33.62 g Na2EDTA 溶于1 L水中，溶解摇匀后，用氢氧化钠或盐酸调pH 至4.0±0.05。

SDZ、SMX、SMZ、SMD、NOF、TC、OTC、CTC、ETM、RTM、TMP、回收率指示物13C-甲氧苄氨嘧啶(13C-TMP)、LEOF 等标准品的纯度不小于97%；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、乙酸均为色谱纯；乙二胺四乙酸二钠盐(Na2EDTA)、一水合柠檬酸(C6H8O7·H2O)、十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)均分析纯；试验用水均为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。

对虾样品随机取自杭州湾南岸的南美白对虾养殖基地中的3个虾塘，每个塘采集10～15尾对虾。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，5μm)，柱温30 ℃。流动相:A 为0.1%(体积分数，下同)乙酸溶液；B 为甲醇；流量0.35 mL·min－1，进样体积10μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

2)质谱条件 电喷雾(ESI)离子源；采用多反应监测(MRM)正离子扫描模式；离子传输毛细管温度350 ℃；鞘气为氮气，流量9 L·min－1；辅助气为氮气，流量3 L·min－1；碰撞气为氩气，流量0.18 mL·min－1；毛细管电压4 000 V；雾化器压力为275.79 k Pa。

目标抗生素的定性/定量离子质荷比和其他质谱参数见表2，其中“∗”为定量离子。

表2 质谱参数Tab.2 MS parameters

表2 (续)

1.3 试验方法

将对虾样品冷冻干燥后，用球磨机磨成粉末状，制成干基样品，置于－20 ℃冷冻保存，待分析。称取对虾粉末状试样1.00 g于50 mL离心管中，加入10 mL体积比为1∶4的含0.1 mol·L－1Na2EDTA的Mcllvaine缓冲溶液-乙腈混合溶液，振荡1 min，常温超声提取10 min，以5 000 r·min－1转速离心5 min，以除去对虾样品中的蛋白质，将上清液转移至离心管中，再重复提取2次，合并提取液。在提取液中加入用乙腈饱和的正己烷20 mL，除去对虾样品中的脂类杂质，振荡5 min，以4 000 r·min－1转速离心10 min。静置分层，弃去上层正己烷，取下层溶液于40 ℃下旋蒸至体积不变，用水稀释至200 mL，确保萃取液中有机溶剂的体积分数小于5%，以防止目标抗生素穿透固相萃取柱而无法保留。

CNWBOND LC-C18固相萃取小柱依次用5 mL甲醇和5 mL 水活化后，将样品溶液以1.0～1.5 mL·min－1的速度过柱，待溶液完全流出后，用5%(体积分数)的甲醇溶液5 mL淋洗柱子，弃去全部流出液，用负压抽干并以6 mL甲醇洗脱柱子，收集洗脱液并吹氮至近干，用甲醇定容至1.0 mL，经0.22μm 针头式过滤器过滤后，在仪器工作条件下进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件对50 ng·L－1的混合标准溶液进行测定，12种抗生素的色谱图见图1。

图1 12种抗生素混合标准溶液的总离子流图Fig.1 TIC chromatogram of the mixed standard solution of the 12 antibiotics

2.2 提取剂的选择

四环素类与氟喹诺酮类抗生素均能与Zn2＋、Fe3＋、Al3＋等金属离子、有机固体颗粒形成稳定的配合物[16-18]，使其提取效率降低，当以含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液为提取剂时，这两种抗生素可以保持电离状态，且氟喹诺酮类抗生素的回收率增加[13]，但是这类提取剂对磺胺类抗生素提取效果较差[19]，可使用乙腈或乙腈和其他缓冲溶液的混合溶液对磺胺类抗生素进行提取[20-23]，同时乙腈能使样品中的蛋白质变性生成沉淀通过离心去除，其在提取肉类残留抗生素时有广泛的应用[24]。

试验考察了以含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液、不同体积比(1∶1、1∶4、4∶1)的含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液-乙腈、乙腈为提取剂时对混合标准溶液添加量为50 ng·g－1的对虾样品中12种抗生素回收率的影响，结果见图2。

图2 提取剂对对虾中12种抗生素回收率的影响Fig.2 Effect of extract on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

由图2 可以看出:以含0.1 mol· L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液或含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液-乙腈(体积比为4∶1)作为提取剂时，磺胺类抗生素的回收率均低于60%；以含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液-乙腈(体积比为1∶1)或含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液-乙腈(体积比为1∶4)为提取剂时，磺胺类抗生素的回收率明显提高，且后者的效果较明显。这是因为磺胺类抗生素难溶于含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液等非极性有机溶剂，添加一定量的乙腈有助于增加磺胺类抗生素的溶解度。试验选择含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine缓冲溶液-乙腈(体积比为1∶4)为提取剂。

2.3 提取剂体积的选择

提取剂的体积不仅影响提取效果，还影响后续的旋蒸时间。试验考察了不同体积(10，15，20 mL)的提取剂对对混合标准溶液添加量为50 ng·g－1的对虾样品中12种抗生素回收率的影响，见图3。

图3 提取剂体积对对虾中12种抗生素回收率的影响Fig.3 Effect of volume of the extract on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

如图3所示:当提取剂体积为10 mL 时，各抗生素的回收率为74%～109%，可满足试验要求；而当提取剂的体积由10 mL增加至20 mL时，磺胺类抗生素的回收率增加约5%，其他类抗生素的回收率没有明显变化。为减少有机溶剂的用量及杂质干扰，缩短后续旋蒸时间，试验选择提取剂的体积为10 mL。

2.4 超声时间的选择

试验考察了不同超声(5，10，20，30 min)时间对混合标准溶液添加量为50 ng·g－1的对虾样品中12种抗生素回收率的影响，见图4。

如图4所示:当超声时间为5 min时，各抗生素的回收率均较低(小于80%)；当超声时间为10～20 min时，提取效果较好且比较稳定；当超声时间为30 min时(超声水浴温度升高10 ℃以上)，各抗生素回收率明显下降，尤其是四环素类和磺胺类抗生素，这是由于随着超声时间的延长，超声对抗生素降解作用越来越明显[25]。试验选择超声时间为10 min。

2.5 固相萃取柱的选择

图4 超声时间对对虾中12种抗生素回收率的影响Fig.4 Effect of ultrasound time on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

在对对虾样品进行提取后，需要使用反相固相萃取柱进行进一步的净化以除去其他杂质。常用的反相固相萃取柱有HLB柱和C18柱，前者使用的填料为亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，其可应用的酸度范围较大；后者以十八烷基键合硅胶为基质，对上样操作要求比较严格。为了排除同种填料净化效果的差异，试验考察了Waters Oasis HLB、Supelco LC-18 和CNWBOND LC-C18等3 种反相固相萃取柱(3种小柱柱容量均为500 mg/6 mL)对混合标准溶液添加量为50 ng·g－1的对虾样品中12种抗生素回收率的影响，见图5。

图5 固相萃取柱对对虾中12种抗生素回收率的影响Fig.5 Effect of SPE column on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

如图5所示:对于四环素类物质，Supelco LC-18小柱的回收率偏低(约60%)，保留能力不如CNWBOND LC-C18小柱，且洗脱液易出现絮状物；而提取液过Waters Oasis HLB小柱和CNWBOND LC-C18小柱后均呈澄清状态，净化效果明显，并且除SDZ、SMD、SMZ、SMX、ETM 外，过CNWBOND LC-C18小柱后的其余7 种抗生素的回收率高于过Waters Oasis HLB小柱的回收率。综合考虑回收率、净化效果及经济成本，试验最终选定的固相萃取柱为CNWBOND LC-C18小柱。

2.6 洗脱剂用量的选择

洗脱剂的用量是影响洗脱效果的重要因素，洗脱剂用量过少会导致洗脱不完全，回收率降低；用量过多，不仅会延长吹氮浓缩的时间，还会引入更多的杂质，影响后续检测。以混合标准溶液添加量为50 ng·g－1的对虾样品为研究对象，试验选择用8 mL甲醇对负压抽干的固相萃取柱分8次进行洗脱，每次1 mL，收集第3、4、5、6、7、8次的洗脱液，按照试验方法进行测定，结果见表2。

表2 不同洗脱次数收集的洗脱液中抗生素的含量Tab.2 Content of antibiotics in eluate collected with the different elution times

由表2可知:第5次的洗脱液中已检测不到目标抗生素，为了保证前处理过程的有效性，试验选择洗脱剂的用量为6 mL。

2.7 色谱条件的优化

当温度高于40℃时，磺胺类抗生素会变得极不稳定[26]。研究发现，在30 ℃的色谱柱温下，3种磺胺类抗生素的吸收值均较高[27]，因此试验选择的色谱柱柱温为30 ℃。

由于试验采用甲醇处理样品，以甲醇作为流动相B时，可以获得尖锐对称的峰形，因此试验选择甲醇作为流动相B。由于酸性的流动相能够增强离子化效果，使抗生素出峰效果更加明显[28]，因此试验选用0.1%乙酸溶液作为流动相A。

2.8 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件对混合标准溶液系列进行测定，用外标法定量。以12种抗生素的质量浓度为横坐标，其对应的的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，12种抗生素的质量浓度均在1～100μg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表3。

按照试验方法对加标量为10 ng·g－1对虾样品进行测定，以3倍信噪比计算12种目标抗生素的检出限(3S/N)，结果见表3。

表3 12种抗生素的线性回归方程、相关系数和检出限Tab.3 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits of the 12 antibiotics

由表3 可知:12 种抗生素的检出限为0.52～3.02 ng·g－1(干重)，说明该方法的灵敏度好，满足我国对水产品药物残留监控的限量要求。

2.9 精密度和回收试验

按照试验方法对空白对虾样品中进行低、中、高等3个浓度的加标回收试验，每个浓度水平平行测定5 次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝5)%

由表4可以看出:对虾中12种抗生素的回收率为70.2%～102%，RSD 均小于14%，说明该方法有较好的准确度和精密度，符合GB/T 27404－2008中的准确度和精密度要求(回收率大于60%，RSD小于20%)。

2.10 方法适用性的验证

饲料和对虾均为富含蛋白质的样品，为验证该方法的适用性，以饲料样品为基底，加入100 ng回收率指示物13C-TMP，按照试验方法进行测定。结果表明:13C-TMP回收率为70.3%～104%，说明本方法对富含蛋白质的饲料样品也具有一定的适用性。

本工作建立了超声萃取溶剂法-高效液相色谱-串联质谱法同时测定南美对虾中12种抗生素的方法，该方法的检出限为0.52～3.02 ng·g－1(干重)；回收率为70.2%～102%，RSD＜14%，符合抗生素类药物残留的检测要求，同时对富含蛋白质的其他样品(如饲料)也具有较好的适用性。