中性红褪色光度法测定白菜中过氧化氢酶活性

武 洋，董 娜，张爱菊，张小林

(甘肃医学院，平凉 744000)

植物体及植物果实在逆境或衰老时，会发生因过氧化氢(H2O2)累积导致的氢氧自由基(·OH)数量增加的现象。·OH 具有强氧化性，会破坏细胞膜，加速细胞的衰老和解体，而过氧化氢酶(CAT)是最重要的酶促防御系统，可清除H2O2、保护细胞，因此CAT 活性是植物新鲜度的一个重要评价指标[1-2]。目前过氧化氢酶活性的测定方法主要有滴定法[3-5]、紫外光度法[6-8]、荧光分析法[9]等，其中，化学动力学光度法[10-14]已成为一大亮点。文献[14]以二苯胺磺酸钠为底物采用CAT 显色动力光度法检测了CAT 的活性，但该方法显色灵敏度较低，H2O2-二苯胺磺酸钠体系的表观摩尔吸光系数(ε)小于1.0×103L·mol－1·cm－1。中性红(NR)是一种偶氮基有色染料，在硫酸介质中能被底物H2O2氧化为无色，Fe3＋可催化加速氧化反应进程，H2O2-NR 体系的ε为1.16×105L·mol－1·cm－1。

本工作在H2O2-NR 体系中加入CAT，以期通过CAT 加入前后吸光度的变化来测定白菜中CAT活性(E)(单位为U·mL－1或U·g－1)。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7230G 型可见分光光度计。

CAT 标准溶液:取适量CAT 标准品(活性为2 000～5 000 U·mg－1)，用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)配制成1 g·L－1(5 000 U·mL－1)CAT 标准储备溶液，用0.020 mol·L－1高锰酸钾溶液标定其含量，然后用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)逐级稀释，配制成1 U·mL－1的CAT 标准溶液。

酸性Fe3＋溶液:0.01 mol·L－1，称取5 g硫酸铁铵于50 mL 烧杯中，加入1 mol·L－1硫酸溶液2 mL，待溶解后转移至100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

NR 溶液:5×10－4mol·L－1，用95%(体积分数)乙醇稀释制得。

H2O2基质溶液:1 mmol·L－1，由30%(质量分数)H2O2溶液稀释制得。

0.1 mol·L－1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)；试剂均为分析纯；试验用水为二次蒸馏水。

1.2 试验方法

称取20 g本地大白菜样品，研碎，用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)定容至1 000.0 mL，取稀释液1.00 mL(酶活小于15 U·mL－1)于50 mL 容量瓶中，再加入H2O2基质溶液5.00 mL，在25 ℃下进行酶催化反应15 min后，立即加入酸性Fe3＋溶液1.00 mL终止酶促反应，再加入NR 溶液3.00 mL，摇匀，在80 ℃水浴中进行褪色反应25 min后加水定容。取适量样品溶液于1 cm 比色皿中，以水为参比，于波长528 nm 处测量其吸光度A。同时完成空白试验吸光度A0测定，根据吸光度的变化ΔA(ΔA＝A0－A)确定CAT 的活性。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

在波长400～600 nm 处对3 种体系(NR、H2O2-NR、CAT-H2O2-NR)的吸光度进行扫描，结果见图1。

图1 吸收光谱图Fig.1 Absorption spectra

由图1可知:NR 在528 nm 处有最大吸收，其峰形尖锐，峰值较高；加入H2O2后，528 nm 处的吸光度降至最低，这是由于H2O2与NR 发生的褪色反应引起的；加入CAT 后，528 nm 处的吸光度又增加至NR 体系的一半，褪色程度被抑制，说明引起褪色反应的核心物质是H2O2。试验选择检测波长为528 nm。

2.2 褪色反应催化剂的选择

由于H2O2氧化NR 发生的褪色反应不明显，而Fe3＋、Fe2＋和Mn2＋对此反应均有催化作用，因此试验考察了Fe3＋、Fe2＋和Mn2＋等3种金属离子的催化效果。结果表明:当c(H2O2)＝0.2 mmol·L－1时，Fe3＋、Fe2＋和Mn2＋对H2O2-NR 体系褪色反应的催化程度不同，Fe3＋作用更显著，因此，试验选择的催化剂为Fe3＋。

2.3 NR用量及体系吸光度范围的选择

NR 溶液的吸光度值取决于溶液酸度和NR 用量，控制pH 不大于6，测定了不同用量的NR 溶液的吸光度。试验发现，当NR 溶液用量在5.00 mL内时，其吸光度与用量的线性关系良好。但为了减少测量误差，试验控制体系的吸光度为0.2～0.7，选择NR 溶液的用量为3.00 mL。

2.4 褪色反应水浴温度及底物H2 O2 用量的选择

试验考察了不同水浴温度和不同底物用量对H2O2-NR 体系吸光度的影响，见图2。

图2 不同温度下底物H2 O2 用量对H2 O2-NR体系吸光度的影响Fig.2 Effect of the amount of substrate H2 O2 on the absorbance of H2 O2-NR system at different temperatures

由图2可知:在2种水浴温度下，H2O2的用量与吸光度均在一定范围内呈线性关系，但80℃时的线性范围更宽(5.00 mL内)，吸光度变化幅度更大。因此，试验选择水浴温度为80 ℃，H2O2的用量为5.00 mL。

2.5 褪色反应时间的选择

试验考察了反应时间对H2O2-NR 体系吸光度的影响，见图3。

由图3可知:随着反应时间的增加，体系的吸光度逐渐降低；在15 min 内，褪色现象明显，15 min后褪色反应速度变缓；25 min时吸光度趋于稳定。为了确保H2O2反应完全和提高测量体系的稳定性，试验选择褪色反应时间为25 min。

2.6 硫酸用量的选择

图3 褪色反应时间对H2 O2-NR 体系吸光度的影响Fig.3 Effect of the discoloration reaction time on absorbance of H2 O2-NR system

酶促反应的终结和褪色反应的发生均需要硫酸，除此之外，硫酸介质还能有效克服Fe3＋水解。取CAT 标准溶液5.00 mL，试验考察了硫酸用量对CAT-H2O2-NR 体系和H2O2-NR 体系吸光度差值(ΔA)的影响。结果表明:ΔA随酸度的增加而降低，当不添加硫酸时，ΔA最大，这说明酸性Fe3＋溶液中所含的硫酸完全满足褪色反应的要求，因此，试验不需要额外加硫酸。

2.7 酶催化反应时间影响

取CAT 标准溶液5.00 mL，试验考察了不同酶催化反应时间对CAT-H2O2-NR 体系吸光度的影响，见图4。

图4 酶催化反应时间对CAT-H2 O2-NR体系吸光度的影响Fig.4 Effect of the enzymatic reaction time on the absorbance of CAT-H2 O2-NR system

由图4可知:在1～8 min内，吸光度随着酶催化反应时间的延长而增加，且单位时间内吸光度变化量一致，符合酶催化一级反应特征。12 min后，吸光度趋于稳定。综合考虑，试验选择酶催化反应时间为15 min。

2.8 标准曲线和检出限

按照试验条件对0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 U·mL－1的CAT 标准溶液系列进行测试，以CAT 的活性为横坐标，其对应的吸光度变化值ΔA为纵坐标绘制标准曲线。CAT 的活性在0.3 U·mL－1内与ΔA呈线性关系，线性回归方程为ΔA＝0.201 1＋1.133E，相关系数为0.998 1。

按照试验条件测定空白11次，以3倍信噪比计算检出限(3S/N)为0.006 8 U·mL－1。

2.9 精密度和回收试验

取大白菜的叶、茎、根等3个部位，按照试验方法进行加标回收试验，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.1 Results of test for precision and recovery(n＝6)

由表1 可知:CAT 的回收率为104%，说明样品中的共存物质不影响酶活性的测定。大白菜叶、茎、根中CAT 活性依次为6.25，9.00，8.00 U·g－1，茎部和根部的CAT 活性更高。

2.10 干扰试验

按照试验方法考察白菜样品中的共存还原性物质(葡萄糖、果糖、维生素C、乳糖、半乳糖)对0.50 mL CAT 标准溶液的干扰情况。结果发现，浓度小于1/2基质溶液浓度的葡萄糖、果糖、维生素C、乳糖、半乳糖不影响ΔA的测定，测量误差小于3%，满足仪器分析的要求。

2.11 自然放置过程中的CAT活性变化

按照试验方法测试了大白菜茎部样品中CAT活性，考察了其随自然放置时间的变化，结果见表2。

表2 自然放置过程中白菜茎部CAT活性的变化(n＝3)Tab.2 Changes of the activity of CAT in the stem of Chinese cabbage during natural placement(n＝3)

由表2可知:CAT 活性随自然放置时间延长而快速下降，4 d后降低至原来的30%。这是由于植物在衰老时，糖类等高分子物质逐渐发生降解，导致H2O2累积、CAT 减少，蔬菜的新鲜度降低。

本工作构建了中性红褪色光度法测定大白菜不同部位CAT 活性的方法，结果令人满意。