黄芪注射液在大鼠肠缺血再灌注肝损伤中的应用实验

郝占伟 吴星星

连云港市第二人民医院儿外科，连云港，222000，中国

机体器官及组织缺血后如果再次得到血液灌注，不仅无法导致器官及组织功能恢复，反而加重结构损伤及功能障碍，这种现象称为缺血再灌注［1］。肠缺血再灌注损伤（intestinal ischemia-reperfusion，IIR）是由于小肠移植、肠梗阻、严重创伤、休克等多种原因引起的一种病理生理现象，既会导致肠损伤，又会致使远隔脏器损伤［2］。肝脏在组织学、解剖学上的特征导致其极易受到肠缺血再灌注损伤的影响，让肝脏代谢解毒水平显著下降，增强微循环阻力，甚至引起肝功能衰竭，其中作用机制可能与线粒体受损、炎症反应、氧自由基损伤、细胞凋亡有关［3］。因此，探究IIR 患者肝保护的有效方法尤为重要。黄芪注射液是由中药材黄芪中提取，具有减少细胞凋亡、缓解炎症反应、清除自由基等作用［4-5］。为探究黄芪注射液在大鼠肠缺血再灌注肝损伤中的应用，本次研究详细报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

9 只成年健康雄性Wistar 大鼠，体质量200～250 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2 试剂

TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒，购自上海烜雅生物科技有限公司；SP 免疫组化染色试剂盒，购自美国ZYMED 公司；Bcl-2 兔抗鼠多克隆抗体（N-19，sc-492）及Bax 兔抗鼠单克隆抗体（P-19，sc-526），购自SantaCruz 公司，美国；黄芪注射液，批准文号：国药准字Z13020999，购自：神威药业集团有限公司，每一支装2 mL，相当于原药材4 g。

1.3 分组及模型制备

将9 只成年健康Wistar 大鼠随机分为3 组，分别为假手术组（Sham 组）、模型组（IIR 组）和黄芪注射液组（黄芪组），每组3 只大鼠，3 组按照再灌注时间划分为3 个不同时相1、3、6 h，3 组每一个时项都是1只大鼠。黄芪组大鼠每日给予一次黄芪注射液，剂量6 mL·kg-1，浓度为2 g·mL-1。Sham 组、IIR 组均给予等量生理盐水，持续给予7 d。实验前，全部大鼠均自由饮水，禁食12 h。d 7 给药1 h 后进行麻醉，给予大鼠腹腔注射20% 乌拉坦，剂量1 mg·kg-1。再给予消毒，在大鼠腹部上半身正中位置行一长度为3 cm 切口，暴露并且游离大鼠肠系膜上动脉（superior mesenteric artery，SMA）。Sham 组大鼠暴露且游离SMA，但是不对SMA 进行夹闭。IIR 组及黄芪组大鼠都通过无创动脉夹将SMA 夹闭1 h，然后再灌注1、3、6 h 不同时间将大鼠处死，取其左叶肝组织作为标本。

1.4 肝组织Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表达水平

利用浓度为10%的中性甲醛对部分肝左叶进行固定，石蜡包埋，具体操作步骤按照SP 免疫组化染色进行。在光镜下进行观察，如果细胞质呈棕黄色或者黄染的颗粒样，评判为阳性反应，而阴性反应为细胞质不染色。阴性对照通过磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗。在显微镜下每一张肝组织切片均随机选择8～10 个高倍镜视野（40×10），通过MIAS-2000 图像分析系统评估阳性区域评估（IOD），该指标衡量阳性产物表达多少，检测全部标本Bax、Bcl-2 表达水平。

1.5 肝细胞凋亡检测

利用缺口末端标注技术（TUNEL）检测肝组织中肝细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）。具体操作方法参照TUNEL 说明书操作，阴性对照并不添加脱氧核糖核苷酸末端转移酶，只是添加标记液。在光镜下进行观察，如果细胞核显示为棕黄色，则判断为凋亡细胞。在显微镜下每一张肝组织切片均随机选择8～10 个高倍镜视野（40×10），AI 计算公式如下［6］。

1.6 统计学方法

应用SPSS 20.0 工具进行处理，符合正态分布的计量资料用（）表示，采用单因素方差分析，3 组中两两组对比采用LSD 法处理，不同时相对比采用重复方差分析，P＜0.05 则表示对比具有明显差异。

2 结果

2.1 Bax、Bcl-2 表达水平

与Sham 组相比，IIR 组与黄芪组再灌注1、3、6 h 3个不同时相Bax、Bcl-2 表达水平均明显提高（P＜0.05），IIR 组再灌注1、3、6 h 3 个不同时相Bcl-2/Bax 降低，黄芪组3 个不同时相Bcl-2/Bax 水平均升高（P＜0.05）。与IIR 组对比，黄芪组再灌注1、3、6 h 3 个不同时相Bcl-2/Bax、Bcl-2 都显著提高，Bax 水平降低（P＜0.05）。同组中不同时相间对比无明显差异（P＞0.05，Tab.1）。

Tab.1 Expression levels of Bax and Bcl-2 in each group

2.2 AI 表达水平

与Sham组相比，IIR组与黄芪组再灌注1、3、6 h 3 个不同时相AI 均显著提高（P＜0.05）。与IIR 组对比，黄芪组3 个不同时相AI 都显著降低（P＜0.05）。IIR 组与黄芪组同组中不同时相间对比具有明显差异（P＜0.05），而且再灌注6 h 最高（Tab.2）。

Tab.2 Expression levels of AI in each group

3 讨论

肠道是缺血再灌注损伤敏感部位之一，既可引起肠道组织凋亡，而且可能导致全身炎症反应，严重的可能引起多脏器功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），因此其被医学界认为是诱发MODS 重要器官［7］。在解剖学上，肝脏同时具有门静脉、体循环双重循环供血的特征，其中大部分血液都来源门静脉，导致肝脏容易受到炎症介质、肠源性毒素、肠缺血等因素的影响［8］。因此，诸多学者对于IIR引起的肝损伤进行大量研究。

黄芪注射液对于大鼠脑、视网膜、小肠、肺部等再灌注损伤都具有保护效果，其作用机制可能与阻断钙超载、清除自由基、抗脂质过氧化等途径有关。

Bcl-2 家族是与细胞凋亡的重要基因，Bcl-2/Bax比值对于细胞受到刺激后是凋亡还是生存具有决定性的作用。与Sham 组相比，IIR 组与黄芪组3 个不同时相Bax、Bcl-2 表达水平均明显提高（P＜0.05），IIR 组3个不同时相Bcl-2/Bax 降低，黄芪组3 个不同时相Bcl-2/Bax 水平均升高（P＜0.05）。与IIR 组对比，黄芪组再灌注1、3、6 h 3 个不同时相Bcl-2/Bax、Bcl-2 都显著提高，Bax 水平降低（P＜0.05）。同组中不同时相间对比无明显差异（P＞0.05）。这提示，大鼠发生IIR 后可导致肝损伤，而且Bcl-2、Bax 表达水平提高，黄芪注射液的作用机制可能在于调节Bcl-2、Bax 表达，与既往研究一致［9-10］。与Sham 组相比，IIR 组与黄芪组再灌注1、3、6 h 3 个不同时相AI 均显著提高（P＜0.05）。与IIR 组对比，黄芪组3 个不同时相AI 都显著降低（P＜0.05）。IIR 组与黄芪组同组中不同时相间对比具有明显差异（P＜0.05），而且再灌注6 h 最高。

综上所述，大鼠发生IIR 后可导致肝损伤，而且Bcl-2、Bax 表达水平提高，黄芪注射液的作用机制可能在于调节Bcl-2、Bax 表达，缓解肝细胞凋亡，具有肝保护效果。