桂郁金SSR-PCR反应体系的建立及优化

靳雅惠

(西安外事学院，陕西 西安 710077)

桂郁金是姜科植物广西莪术CurcumakwangsiensisS. G. Lee et C. F. Liang 的干燥块根，是《中国药典》规定的郁金的来源之一，具有活血止痛，行气解郁等功效[1]，常用于胸胁刺痛，胸痹心痛等症的治疗。随着临床上药材需求的不断增加，桂郁金作为郁金的主要来源，产量占比60%[2]。然而，桂郁金种质资源丰富，且存在着较大的差异性，种质资源没有一套完善的评价标准。所以，迫切需要从分子水平着手，揭示不同种质内在的差异性，从基因角度筛选出优良种质，为桂郁金的临床用药等方面提供帮助。

简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)，是一种重复单元，通过1～6个核苷酸串联重复序列组成[3]。它以PCR反应为基础，目前已经广泛应用到功能基因研究[4]，遗传多样性分析[5]，遗传图谱构建[6]等方面的研究。SSR-PCR体系重复性高，稳定性好，却极易受到引物，模板，以及2×Taq PCR MasterMix(Tap DNA 聚合酶，dNTPs,缓冲液等)因素的影响。目前，尚未见对桂郁金SSR-PCR反应体系建立与优化的报道，因此，笔者研究可以为桂郁金遗传多样性等相关研究提供参考。

1 材料

实验所用不同种质的桂郁金材料均采自邕宁桂郁金种植基地，经广西中医药大学王建教授鉴定均为桂郁金，即广西莪术CurcumakwangsiensisS. G. Lee et C. F. Liang 的干燥块根。PCR使用的Mix PCR MIX(包括Tap DNA 聚合酶，dNTPs,缓冲液等)是2x浓缩的PCR扩增预混合溶液，从博瑞克公司购入。要进行PCR，只用在体系中加入模板及引物，不但去掉了复杂的操作过程，还大大节约了时间。实验所使用的引物为国外已经公布的姜黄属通用引物。序列为5’→3’(AACGAAGTCGGTGGCGGGAGGTCAAGAACGGTAGG)。通过上海生工合成。

2 方法

2.1 DNA提取

取桂郁金嫩叶0.5～1.0 g，采用杨妮[7]等改良CTAB法进行DNA提取，紫外分光光度计被用以检测DNA的质量及浓度。

2.2 SSR-PCR反应体系的正交设计

运用L9(33)正交设计，对DNA模板，引物以及2×Taq PCR MasterMix的含量进行考察。如表1所示。每次试验均加入适量的ddH2O，使反应体系的总量为15μL。

2.3 SSR-PCR反应程序的正交设计

SSR-PCR反应程序采用L16(44)正交设计，对退火时间、变性时间、循环次数、延伸时间进行考察，以期获得最佳的反应程序。如表2所示。

表1 SSR-PCR反应体系正交设计

表2 SSR-PCR反应程序的正交设计

2.4 退火温度的选择

在上述SSR-PCR反应体系建立的基础上，设定温度梯度：54.0℃、54.5℃、55.0℃、55.5℃、56.0℃、56.5℃，筛选出最佳的退火温度。

2.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR反应产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%)检测，以此来确定最优的反应体系、反应程序、退火温度以及体系的稳定性和适用性等内容。

3 结果分析

3.1 DNA质量与浓度检测

采用紫外分光光度计对提取得到的桂郁金DNA的质量和浓度进行检测，OD260/OD280值为1.8～2.0，浓度50μg·mL-1，此结果表明，该DNA可用于后续实验。

3.2 SSR-PCR反应体系的优化

对实验建立的9个不同组合进行分析与优化，由于模板，引物以及MIX含量的不同，结果差异明显。如图1所示。9个组合均能扩增出条带，5,7,8,9反应体系扩增得到的条带弱，特异性差，2,3,4,6反应体系扩增得到的条带较清晰，其中反应体系4条带多，特异性最好。即在15μL体系中，DNA模板2.5μL,引物1.0μmol·L-1,2×Taq PCR MasterMix为6μL，其中Tap DNA聚合酶0.05 U·μL-1，Mg2+3.0 mmol·L-1，dNTPs0.3 mmol·L-1，加ddH2O至15μL。

图1 桂郁金SSR-PCR反应体系 L9(33)正交设计试验扩增效果

3.3 SSR-PCR反应程序的优化

对实验所建立的16组SSR-PCR反应程序的不同组合进行分析与优化，结果如图2所示。组合条件的不同导致了扩增条带的差异。表现为条带的颜色深浅不同，效果存在着较大区别。组合2,13,14条带较浅，稳定性也较差，反应体系不理想，综合实验结果，反应程序10条带清晰，稳定性较好，因此将反应程序10(变性30 s,退火30 s，延伸45 s，循环35次)作为最优方案。

图2 桂郁金SSR-PCR反应程序L16(44)正交设计试验扩增效果

3.4 退火温度的确定

退火温度的确定是利用以上确定的最佳反应体系及反应程序进行的，本梯度试验的范围是54.0～56.5℃。结果如图3所示。当温度低于54.5℃时，主带不清晰，且有许多较浅的杂带，当温度超过55.5℃时，条带的稳定性以及多态性下降。在退火温度为55℃时，条带的清晰度，稳定性等均较好，由此确定55.0℃为最佳的退火温度。

1-2: 54.0℃、3-4:54.5℃、5-6:55.0℃、7-8:55.5℃、

3.5 优化体系的验证

采用10份不同种质的桂郁金材料对优化得到的体系进行验证。扩增结果如图4所示，10份桂郁金材料均可以扩增出清晰、多态性高、重复性好的条带，由此也证明了该优化体系的合理性和适用性。

图4 10份桂郁金材料扩增效果

4 讨论

桂郁金遗传多样性分析以及种质筛选等研究是以SSR-PCR反应体系，反应程序，退火温度的建立与优化为前提和基础进行的。由于不同植物类别并没有一套通用的SSR-PCR反应体系，因此建立适合桂郁金的SSR-PCR反应体系是十分必要的。该体系受到了多方面的影响，包括DNA浓度，引物浓度以及2×Taq PCR MasterMix含量的相互作用。笔者实验与传统的SSR-PCR反应体系建立与优化略有不同，传统的SSR-PCR反应体系是采用单因素考察的方法，对体系内各种组分进行含量的确定，虽然结果直观，却忽略了系统的整体性，即各组分之间的相互影响与内在联系。笔者实验采用正交优化的方法，正好弥补了单因素考察的缺陷，充分权衡了组分内在的关联，而且缩短了实验周期，省时省力。传统的SSR-PCR反应体系的建立与优化，通常是考察5种因素对该体系的影响，包括(DNA模板，引物，Tap DNA聚合酶，Mg2+，dNTP)，笔者实验采用了2×Taq PCR MasterMix，将原本复杂的5因素变成了3因素，使反应体系的建立与优化化繁为简，为后续的实验提供了便利。笔者实验建立了可用性高，稳定性好的桂郁金SSR-PCR反应体系，通过10份桂郁金材料得到验证。

在PCR反应中，适合的退火温度是确保引物以及目的序列可以顺利退火的关键因素。如果退火温度过低，就会增加非特异性结合的机率，从而使杂带数量增加；如果退火温度过高，那么就可能导致不能完全退火或者无法退火，从而导致无法扩增。为了加快实验进程，笔者实验采用的引物是国外已经公布的姜黄属通用引物，而引物碱基的组成，长度等因素恰恰影响着退火的时间和温度。在后续试验中，应该涉及到桂郁金引物开发的相关内容，在该体系的基础上继续优化，设计并筛选出多态性好，重复性高的引物，使桂郁金的SSR-PCR反应体系更加完善，适合于分析桂郁金的遗传多样性以及筛选优良种质资源等研究。