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lncRNA HOST2通过PI3K/Akt途径调控卵巢癌SKOV3细胞对顺铂的敏感性

2020-07-06韩建秋郝丽惠邢雅玲张艳吴维光

天津医药 2020年6期
关键词:空白对照卵巢癌敏感性

韩建秋,郝丽惠,邢雅玲,张艳,吴维光

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,2018年全球新发病例超过29.5万例,死亡病例超过18.4万例[1]。2015年我国确诊卵巢癌患者约52 100例,卵巢癌患者死亡约22 500 例。晚期卵巢癌患者在5年内出现对铂类化疗药物耐药而复发的比例高达70%,是卵巢癌治疗失败的重要原因[2]。探索卵巢癌耐药的分子机制,提高卵巢癌细胞顺铂敏感性成为当前的研究热点。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是长度超过200个核苷酸的功能性RNA 分子,通常缺失开放性阅读框,可导致原癌基因或抑癌基因表达失衡[3]。上皮性卵巢癌转录因子2(HOST2)是一种在卵巢癌细胞中高表达的lncRNA[4],参与乳腺癌[5]、肝细胞癌[6]、脑胶质瘤[7]、胰腺癌[8]等多种恶性肿瘤的发生发展。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)信号通路是多种生长因子、细胞因子的下游信号转导通路,其在卵巢癌细胞增殖及铂类耐药中起重要作用。目前有关卵巢癌细胞lncRNA HOST2 表达与PI3K/Akt 信号通路关系的研究报道尚少见。本研究应用RNA 干扰(siRNA)技术,下调卵巢癌 SKOV3 细胞lncRNA HOST2 表达,探讨 lncRNA HOST2 对卵巢癌SKOV3细胞顺铂敏感性的调控作用及相关机制,为提高卵巢癌化疗敏感性提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人卵巢癌SKOV3细胞购自武汉典型培养物保藏中心;RPMI1640 培养液、胎牛血清、兔抗人IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物科技有限公司;注射用顺铂(10 mg)购自齐鲁制药;FITC-annexin V 凋亡试剂盒、RNA 提取试剂盒、Lipofectamine 2000转染试剂、胰蛋白酶、总蛋白提取试剂盒购自Invitrogen 公司;反转录试剂盒、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)试剂盒、CCK-8 试剂盒购自TaKaRa 公司;硝酸纤维素(PVDF)膜和蛋白Marker 购自美国NEB 公司。层流超净工作台、qPCR 仪(Bio-Rad 公司,美国),电泳仪(六一仪器厂,北京),台式高速离心机(5415DR,Eppendorf公司,德国),CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 SKOV3细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基,置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中常规培养,每1~2 d 更换培养液,待细胞融合度达80%~90%时,用胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞,以1×106个/孔接种于6孔板,更换无血清的RPMI1640培养基,待细胞贴壁生长至融合度为60%时进行细胞转染。实验设空白对照组、阴性对照组和siRNA 干扰组,其中空白对照组未进行转染,阴性对照组和siRNA 干扰组SKOV3 细胞应用Lipo⁃fectamine 2000 分别转染阴性对照siRNA 和lncRNA HOST2-siRNA,按Lipofectamine 2000 转染试剂盒说明书进行操作。siRNA 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,lncRNA HOST2-siRNA 序 列 为 :正 义 5'-GACUAAACAAGGU⁃CUUAAUTT-3',反 义 5'-AUUAAGACCUUGUUUAGUCTT-3';阴性对照siRNA 序列为:正义5'-UUCUCCGAACGUGU⁃CACGUTT-3',反义 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。转染6 h后更换RPMI1640完全培养基,48 h后进行相关指标检测。

1.2.2 RNA提取及反转录 采用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,应用反转录试剂盒反转录为cDNA。反转录体系:RNA 2 μg,随机引物1 μL,反应缓冲液1 μL,RNA酶抑制剂1 μL,dNTP 1 μL,逆转录酶1 μL。转录条件为:65 ℃ 5 min,42 ℃ 1 h,70 ℃ 5 min。cDNA于-20 ℃储存。

1.2.3 qPCR 法检测lncRNA HOST2表达情况 应用SYBR Premix Ex Taq 试剂盒,以 β-actin 为内参照,PCR 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成,序列见表1。反应体系(20 μL):2×SYBR Green Mix 10 μL,ROX 0.4 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,ddH20 7.0 μL,cDNA 1.0 μL。反应条件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

Tab.1 qPCR primer sequences表1 qPCR引物序列

1.2.4 Western blot 检测PI3K/Akt 信号通路相关蛋白的表达 应用蛋白裂解液,冰上裂解SKOV3 细胞10 min,提取细胞总蛋白,BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。定量后取20 μg 上样,进行 12%SDS-PAGE 凝胶电泳,分离后电转移至PVDF 膜上,脱脂牛奶(50 g/L)封闭,洗膜,加入兔抗人一抗(1∶500稀释)及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶2 000稀释),ECL 发光压片显色,以β-actin 蛋白作为内参照,用Quantity One 软件对PI3K/Akt 信号通路相关蛋白Akt、p-Akt(S473)、p-Akt(S380)及 Bcl-2 条带的光密度(OD)值进行分析。

1.2.5 顺铂作用于细胞 分别取3组细胞,无双抗培养液重悬为单细胞悬液,体积为100 μL,按2×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板,置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h。更换含顺铂浓度为0、20、40、60、80、100 μmol/L 的培养基,继续培养24 h。

1.2.6 CCK-8法检测细胞存活情况 应用CCK-8试剂盒,取不同浓度顺铂作用后的96 孔培养板,按10 μL 每孔加入CCK-8液,培养2 h后在酶标仪上检测450 nm处的OD值,每组设3个复孔,取平均值,计算3组不同浓度顺铂作用下的细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD 值-空白孔OD 值)×100%。应用SPSS 17.0 软件的Probit 程序计算半抑制浓度(IC50)。以细胞存活率为纵坐标,顺铂浓度为横坐标,绘制细胞存活曲线。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡率 FITC-annexin V凋亡试剂盒取20 μmol/L 顺铂作用24 h 后的3 组细胞,胰蛋白酶消化,室温下1 600 r/min 离心10 min,弃上清,预冷的PBS 液洗涤细胞2次,2 000 r/min离心8 min,弃上清,500 μL结合缓冲液重悬细胞,分别加入5 μL的Annexin V和5 μL的碘化丙锭(PI)。震荡混匀后采用流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差()表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较行LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA对卵巢癌SKOV3细胞lncRNA HOST2表达的影响 qPCR 结果显示,siRNA 干扰组lncRNA HOST2表达水平(0.55±0.15)低于空白对照组(1.00±0.00)和阴性对照组(0.98±0.24),差异有统计学意义(n=3,F=5.217,P<0.05)。

2.2 下调lncRNA HOST2 对卵巢癌SKOV3 细胞PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达的影响 Western blot 结果显示,siRNA 干扰组 p-Akt(S473)、p-Akt(S380)和Bcl-2 蛋白表达水平均低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);3 组Akt 蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),见表2、图1。

2.3 下调lncRNA HOST2表达对顺铂作用下SKOV3细胞存活率的影响 CCK-8 法检测结果显示,3 组细胞存活率均随顺铂药物浓度的增加而降低,见图2。空白对照组、阴性对照组和siRNA 干扰组IC50分别 为(59.58±5.97)、(51.42±5.22)和(39.75±5.31)μmol/L,siRNA干扰组IC50明显低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(n=3,F=9.819,P<0.05),见图2。

Tab.2 Comparison of PI3K/Akt signal transduction pathway-related protein expressions between three groups表2 3组PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平比较(n=3,%,)

Tab.2 Comparison of PI3K/Akt signal transduction pathway-related protein expressions between three groups表2 3组PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平比较(n=3,%,)

*P<0.05;a与空白对照组比较,b与阴性对照组比较,P<0.05

组别空白对照组阴性对照组siRNA干扰组F Akt 55.72±3.42 58.43±4.13 51.69±4.26 2.202 p-Akt(S473)41.64±3.91 43.42±4.25 32.97±3.83ab 5.860*p-Akt(S380)36.82±3.63 34.54±3.21 21.65±3.94ab 15.425*Bcl-2 30.42±2.74 28.37±3.15 19.68±3.06ab 10.905*

2.4 下调lncRNA HOST2表达对SKOV3细胞凋亡的影响 siRNA干扰组细胞凋亡率(12.42%±1.46%)明显高于空白对照组(7.53%±1.25%)和阴性对照组(8.16%±1.31%),差异有统计学意义(n=3,F=11.753,P<0.05),见图3。

3 讨论

迄今为止,人类基因组测序发现约98%的基因转录产物为非编码RNA,包括lncRNA 和微小RNA(microRNA)。lncRNA与肿瘤的发生发展关系密切,其能够在染色体修饰、基因组印记、转录过程中调控下游基因的表达,进而导致细胞分化异常[9-10]。lncRNA HOST2 长度约为 2.9 kb,它是由 Rangel 于2003 年在卵巢癌细胞株和原位癌中发现的一种高表达lncRNA[11]。已有研究证实lncRNA HOST2参与卵巢癌细胞的增殖、侵袭及凋亡等多种生物学过程[12]。

顺铂作为治疗卵巢癌最常用的化疗药物之一,可与DNA 和非DNA 靶点结合,形成交联及单加合物,从而阻断DNA复制并诱导细胞凋亡。卵巢癌病死率位居妇科肿瘤之首,细胞耐药是导致其高病死率的重要原因之一。Feng 等[13]研究发现,抑制宫颈癌细胞lncRNA ZFAS1 的表达可增强其对顺铂的化疗敏感性。本研究应用siRNA 技术抑制卵巢癌SKOV3细胞lncRNA HOST2的表达,结果显示,下调lncRNA HOST2表达后,3组细胞存活率均随顺铂药物浓度的增加而降低,而siRNA干扰组IC50明显低于空白对照组和阴性对照组,SKOV3细胞凋亡率明显高于空白对照组和阴性对照组,提示抑制lncRNA HOST2 表达可增强SKOV3 细胞对顺铂的敏感性。检测肿瘤细胞内lncRNA HOST2 水平对于预估化疗敏感性具有重要意义。

PI3K/Akt 信号通路是参与细胞增殖、凋亡及能量代谢的关键信号转导通路,该通路的活化与顺铂、阿霉素等化疗药物的耐药密切相关[14]。Ma 等[15]研究发现,lncRNA DANCR 可通过激活 PI3K/Akt 信号通路,导致神经胶质瘤细胞对顺铂的耐药性。PI3K属于磷脂激酶家族,是由一个P110催化亚基单位和一个P85调节亚基单位组成的异二聚体结构。作为联系细胞外信号与细胞应答效应的桥梁分子,PI3K能够被许多细胞外因子激活。活化的PI3K 使二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)磷酸化成三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3),进一步激活Akt。激活的Akt从细胞膜异位到细胞质和细胞核中,通过抑制或激活下游靶蛋白,进而参与调控细胞增殖、分化及血管生成。研究发现,卵巢癌细胞中Akt活化增加,激活的PI3K/Akt信号通路导致卵巢癌细胞耐药及不良预后。抑制该通路能够明显减少卵巢癌细胞增殖,增加顺铂诱导的细胞凋亡[16]。本研究结果显示,下调lncRNA HOST2 后,卵巢癌 SKOV3 细胞中 p-Akt(S473)、p-Akt(S380)和Bcl-2 蛋白表达水平均明显降低,提示沉默lncRNA HOST2 能够抑制PI3K/Akt 信号通路的激活,从而增强SKOV3细胞对顺铂的敏感性。

综上所述,lncRNA HOST2可通过PI3K/Akt信号通路参与调控卵巢癌SKOV3细胞的增殖、分化及凋亡,抑制lncRNA HOST2 表达可增强SKOV3 细胞对顺铂的敏感性。

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