10种中药颗粒剂对耐碳青霉烯类肠杆菌体外抑菌作用研究

兰小琴 林楠 杨大超 苏霄翔 闫学平 郭建巍

[摘要] 目的 研究五倍子等10种中药颗粒剂对耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）体外抑菌作用。 方法 收集2017年5月～2018年7月北京市第一中西医结合医院检验科细菌室低温保存的CRE菌株20株。选用肉汤稀释法，检测10种中药颗粒剂对CRE最低抑菌濃度（MIC），分析检测10种中药颗粒剂对CRE体外抑菌活性。 结果 五倍子、黄连对CRE有一定的抑菌作用，MIC值分别为125、500 mg/mL，大黄、黄芩、金银花、蒲公英、黄柏、苍术、板蓝根、鱼腥草均未表现出抑菌作用。中药作用前后临床常用抗菌药物MIC值无变化，未表现出中药逆转耐药作用。结论 五倍子、黄连对CRE有抑菌效果，具有开发前景。

[关键词] 中药颗粒;耐碳青霉烯类肠杆菌;最低抑菌浓度;体外抑菌

[中图分类号] R446.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）05（a）-0169-04

Study on antibacterial effect of 10 kinds of traditional Chinese medicine granules on carbapenem-resistant Enterobacteriaceae in vitro

LAN Xiaoqin   LIN Nan   YANG Dachao   SU Xiaoxiang   YAN Xueping   GUO Jianwei

Department of Clinical Laboratory， Beijing First Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine， Beijing   100026， China

[Abstract] Objective To study the antibacterial effect of 10 kinds of traditional Chinese medicine granules such as Galla Chinensis on carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE） in vitro. Methods Twenty strains of CRE were collected from Department of Clinical Laboratory of Beijing First Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine from May 2017 to July 2018. The broth dilution method was used to detect the minimum inhibitory concentration （MIC） of 10 traditional Chinese medicine granules against CRE. The antibacterial activity of 10 traditional Chinese medicine granules against CRE was analyzed and tested. Results Galla Chinensis and Coptis Chinensis have a certain bacteriostatic effect on CRE， with MIC values of 125 and 500 mg/mL， respectively. Rhubarb， Scutellaria baicalensis， Honeysuckle， Dandelion， Phellodendron， Atractylodes， Radix Isatidis and Houttuynia Cordata have not shown Antibacterial effect. There was no change in the MIC value of the commonly used antimicrobial drugs before and after the action of traditional Chinese medicine， and it did not show that the traditional Chinese medicine reversed drug resistance. Conclusion Galla Chinensis and Coptis Chinensis have antibacterial effect on CRE and have development prospects.

[Key words] Traditional Chinese medicine granules; Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; Minimal inhibitory concentration; Inhibitory effect in vitro

碳青霉烯类抗菌药物因其抗菌谱广，对β-内酰胺酶稳定，曾被作为革兰阴性杆菌感染最有力的“杀手锏”。随着该类药物使用率不断升高及不规范、无指征的滥用，细菌对该类药物的耐药性也在不断增加。耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）目前全球广泛流行，尤其在重症监护室、器官移植病房、甚至儿科都成为重灾区，感染与高死亡率相关，有效治疗有限，用于多重耐药感染最后防线的碳青霉烯类药物对其无效。中医药在细菌性感染疾病的预防和治疗方面有着悠久的历史，在灵活实现药物间协同、难产生耐药性、逆转细菌耐药等方面，中药方剂抑菌有其独有的优势。筛选对耐药菌活性强的中药，并进一步研究开发，是解决耐药菌感染问题的一个突破口。经文献检索，有关中药对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌均表现出抑菌效果[1-4]，但未见中药对CRE抑菌、杀菌的研究报道。中药颗粒剂携带方便、无需煎煮、质量可控等优势，目前逐渐受到大家欢迎。因此，本研究观察10种中药颗粒剂对CRE的体外抑菌活性，筛选对CRE有抑菌效果的中药，以期为临床治疗CRE感染提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株  收集2017年5月～2018年7月北京市第一中西医结合医院（以下简称“我院”）检验科细菌室低温保存的耐碳青霉烯类肠杆菌菌株20株，菌株均从我院临床标本（包括血液、尿液、痰、分泌物等）中分离培养获得。使用法国梅里埃公司的VITEK-2 Compact及配套试剂对细菌进行鉴定及药物敏感实验，CLISM100-S25作为药敏诊断参照标准。

1.1.2 药品  五倍子、黄连、大黄、黄芩、金银花、蒲公英、黄柏、苍术、板蓝根、鱼腥草共10种中药颗粒剂由我院中药房提供，由江阴天江药业有限公司公司生产。

1.2 仪器与试剂

Ⅱ级生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司，型号：BSC-1500Ⅱ A2-X）;细菌鉴定药敏仪（公司法国梅里埃公司，型号：VITEK-2 Compact）;细菌浊度仪（公司法国梅里埃公司，型号：DensiCHEK plus）;GN鉴定卡（公司法国梅里埃公司，批号：2410883103）;AST-GN09藥敏卡（公司法国梅里埃公司，批号：1061170103）。CO2培养箱（松下公司，型号：MCO-18AC）;MH营养肉汤（青岛高科园海博生物技术有限公司，批号：20180127）;中国蓝平板（天津市金章科技发展有限公司，批号：06122312）;普通琼脂平板（天津市金章科技发展有限公司，批号：68811612）;高压灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司，型号：TMQ.C）;分析天平（艾德姆衡器有限公司，型号：PWC124，精度：0.0001 g）;移液器（德国Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 中药药液的制备  用天平称取30 g中药配方颗粒，用30 mL无菌蒸馏水震荡溶解，医用高压锅高压灭菌（112℃，20 min），取出放凉，此时制备的中药颗粒剂药液浓度相当于生药的质量浓度为1000 mg/mL，按此方法分别制备10种中药颗粒剂药液备用。

1.3.2 细菌培养与菌悬液的制备  取预先保存的菌株，在中国蓝平板上分区划线，分离传代，3代培养传代后，观察菌落形态，GN鉴定卡、AST-GN09药敏卡再次确认为CRE，用无菌生理盐水校正为1×106 cfu/mL的菌悬液，备用。

1.3.3 MH肉汤培养基的制备  按说明书称取肉汤培养基干粉，边加热边搅拌溶解于蒸馏水，待培养基全部溶解清亮透明后，高压灭菌，备用。

1.3.4 最低抑菌浓度（MIC）测定采用试管二倍稀释法做体外抑菌试验  各中药供试液（初始质量浓度1000 mg/mL）用MH肉汤培养基连续倍比稀释7个浓度，取9支预先已灭菌的试管。首先向1～7支试管中加入已灭菌的肉汤培养基2 mL。后向第1支试管中加入2 mL已制备好的中药颗粒剂药液，混匀后吸出2 mL加至2号试管中，混匀后再从第2支试管中吸出2 mL加至3号试管中。如此稀释至第7管，此管混匀后弃去2 mL。则2～7管药物稀释倍数依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64（其浓度分别为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81 mL），再向各试管中加人0.1 mL细菌悬液。第8支试管为2.0 mL培养基加0.1 mL的细菌悬液作为阳性对照，第9支试管为2.0 mL培养基加2.0 mL中药药液作为阴性对照，于37℃ CO2培养箱中培养24 h，观察抑菌效果。24 h后转种于普通琼脂培养基再培养24 h，观察有无菌落生长，有菌生长记为“+”，无菌生长记为“-”。以不出现细菌生长的试管的中药浓度，作为该味中药MIC。

1.3.5 中药逆转耐药细菌效果测定  分别将10种中药颗粒剂配制成低于最低抑菌浓度的药液共5个梯度浓度，加入0.1 mL的细菌悬液，培养24 h后，再接种至营养琼脂平板内。继续培养24 h后挑取菌落制成菌悬液，采用VITEK-2 Compact配套的药敏卡行药敏试验，检测其对临床常用抗菌药物的敏感性，观察中药作用前后抗菌药物MIC值变化。

2 结果

2.1 中药颗粒剂对CRE抑菌作用

五倍子对CRE抑菌作用最强，MIC值为125 mg/mL;黄连也有一定的抑菌作用，MIC值为500 mg/mL。其他8味中药大黄、黄芩、金银花、蒲公英、黄柏、苍术、板蓝根、鱼腥草未表现出对CRE的抑菌作用。见表1。

2.2 中药逆转耐药细菌效果测定

五倍子、黄连中药颗粒剂作用后的CRE行药敏试验，结果中药作用前后临床常用抗菌药物MIC值无变化，未表现出中药逆转耐药作用。其余8种中药颗粒剂在实验中未测得MIC，对CRE无抑制作用。

3 讨论

近几年，随着长期大量、不规范合理使用碳青霉烯类抗生素（包括亚胺培南、美罗培南等）导致对其耐药的肠杆菌科细菌呈广泛增长的趋势，在世界范围内越来越流行。2001年美国首次发现1株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，此后许多国家及地区相继报道发现CRE。2006年，我国首次报道发现1株产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，此后在我国CRE的报道逐渐增多，给临床带来严峻挑战。患者本身合并多种基础疾病、免疫力低下、侵袭性操作、广谱抗菌药物的使用，是CRE定植或感染的危险因素。临床治疗CRE感染，单一用药很难控制，目前多采用多种抗生素联合用药方式，来治疗CRE细菌感染引起的肺炎、血流感染等，但治疗效果仍有待提高。

我国运用中药治疗感染性疾病历史悠久，中药的抑菌、杀菌效果肯定，随着现代化学技术的不断进步，循证医学的发展，中药抗菌活性成分、抗菌单体被提取到并完成其化学成分、分子结构的检测。本实验结果显示，五倍子、黄连对CRE有一定的抑菌作用，MIC值分别为500 mg/mL和125 mg/mL。而五倍子的常规用量仅为3～10 g，口服后经药物代谢，到达病变部位的药物浓度远达不到所需的血药浓度。因此，采用口服中药的方式治疗CRE引起的肺部感染，治疗效果将大打折扣。中药治疗呼吸道感染性疾病，可通过吸入给药的方式提高局部药物浓度。大量研究报道[5-11]，中药雾化吸入的方式治疗肺炎和上呼吸道感染取得不错的效果。本研究结果显示，五倍子和黄连对CRE有不同的体外抗菌活性，采用中药雾化吸入治疗CRE引起的呼吸道感染性疾病值得一试。另外，中药可根据需求进行组方，通过药物间协同减少单一味中药的用量，提高药物作用浓度[2]。CRE的感控管理也是一项不容忽视的问题。CRE的传播多发生在住院患者之间或患者与医护间，对CRE有抑制作用的中药药液能否制备成消毒液，在病房环境清洁消毒、医护手卫生、减少交叉感染、防治CRE扩散传播方面发挥作用，值得进一步研究开发。中药抗菌活性成分研究也是目前研究热点，中药抗菌的有效成分主要包括生物碱类、黄酮类、醌类、萜类和有机酸类以及一些中药经过肠道细菌作用后的代谢产物[12]。五倍子的化学成分主要包括鞣质、没食子酸、油酸、亚油酸等。相关研究显示[13-14]，鞣质易使蛋白质凝固，对细菌、真菌等多种病原微生物表现出明显的抑制作用，同时具有抗耐药菌作用。汪晶等[15]研究显示，五倍子对产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌有较强的抑菌活性，可消除该细菌质粒，逆转细菌耐药性。细菌耐药机制多变，且经常多种机制同时存在产生多重耐药，中药也通过多种机制发挥抑菌作用。因此，研究中药药理机制，进一步提取其活性成分，可提高药物作用浓度，才能更好地发挥中药的抑菌效果。

中药发挥抗菌作用主要以清热解毒类药为主，内服可调节患者免疫功能，与抗生素连用，对抗生素有增效和减毒的效果，中西药互补联用才能更好地解决临床细菌耐药问题[16-19]。在西药治疗基础上，辅以抑菌效果较好的中药，可提高抗菌效果，缩短抗生素使用时间，减少耐药性和毒副作用产生[20-23]。部分中药可以逆转细菌耐药，潘杰等[24]研究显示，中药逆转后耐药菌对抗生素的敏感程度提高，耐药性较低;鲁茹等[25]研究显示，白及醇提物能够有效降低苯唑西林对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC。中药逆转细菌耐药性机制包括：破坏细菌细胞壁结构、抑制β-内酰胺酶、消除质粒、抑制耐药菌主动外排泵等。本研究10味中药颗粒剂中，五倍子、黄连表现出抑菌作用，但未表现出对CRE的逆转耐药作用，抗菌机制有待进一步研究。

中药取材广泛，价格低廉，抗菌活性强，加强对中药抗耐药菌的研究和开发，中西药合用提高抗菌效果，对解决耐药细菌感染具有临床意义。中药给药途径方面，也要打破常规，开拓创新，让中药在抗菌方面发挥更大作用。本研究不足之处在于，中藥抑菌的研究多停留在体外实验，而中药进入体内发挥作用不仅依靠其本身的抑菌作用，还对人体免疫系统进行调节。然而，抗菌机制复杂，体外实验难以复制，不能对其进入体内的综合效应进行评估[26-29]。因此，今后实验需进行体内外结合，评估中药抗菌效果提供临床依据。

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（收稿日期：2020-01-05  本文编辑：王晓晔）