基于加权基因共表达网络(WGCNA)挖掘肺动脉高压疾病的关键基因

李宗瑾 宋长新

摘要：肺动脉高压（pulmonary arterialhypertension，PAH）是一种严重的心血管疾病，发病机制复杂，分子机制尚未完全阐明，临床死亡率仅次于肿瘤与心肌梗死，严重威胁人类的生命健康。因此，需要更多的方法来探究PAH的分子机制，挖掘影响其发生的关键因子。该文将PAH疾病的分子研究与加权基因共表达网络（WGCNA）相结合，通过构建PAH加权基因共表达网络，探讨其潜在生物标志物，筛选可能与PAH显著相关的关键基因，为PAH的预防及早期治疗提供理论与实践基础。

关键词：PAN;WGCNA;关键基因;生物标志物

中图分类号：TP391文献标识码：A

文章编号：1009-3044（2020）15-0008-02

1背景

PAH是一种病因不明、受遗传与环境等多因素共同影响的综合征。其特征是肺动脉压力和血管阻力增加导致右心衰竭和死亡，诊断后平均生存时间为2.8年。近年来，随着对PAH发病机制的深入研究，发现遗传因素在其发病中起着重要作用。目前，仍存在治疗难度大、药物敏感性低及预后极差的问题，因此需要更多方法来发现潜在的关键（枢纽）基因，进而揭示其分子机制，进而降低其死亡率。WGCNA是一种系统生物学方法，是以基因间表达相似性为基础来实现基因网络构建的算法，常用来探索基因和表型之间复杂关系，不仅可以筛选具有价值的生物标志物或靶位点的鉴定，还具有揭示生物学规律、疾病关键驱动因子和药物作用机理的功能。在本研究中，我们利用GEO数据库中的PAH表达谱数据构建了加权基因共表达网络，筛选可能影响PAH疾病发生的关键因子，为实现PAH的早期预防与及时治疗提供理论基础。

2材料与方法

2.1数据来源及数据预处理

本文的PAH基因表达谱数据fGSEll7261）来自GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，），包含25个正常人类样本，和58个PAH样本，平台为GPL6244。本研究使用R编程语言（v3.6.2），Bioconductor软件包和WGCNA軟件包进行数据分析。

2.2共表达网络的构建和模块构建

我们使用R中的WGCNA软件包来构建PAH加权基因共表达网络。首先，计算所有基因对的相关性构建Pearson相关矩阵，如公式（1）。然后，使用幂函数nil=Allg将相关矩阵转换为邻接矩阵，其中β是一个可以强调强相关性的软阈值，软阈值p可以使网络符合标准的无尺度网络，从而实现无标度拓扑。第三，将邻接矩阵转换为拓扑重叠矩阵（TOM），如公式（2），并计算基因间相异度矩阵dissTOM=1-TOM，对dissTOM层次聚类得到系统聚类树，即将具有相似表达的基因分为同簇。第四，通过dynamic Tree Cut动态剪枝算法来区分共表达模块，其中min-ModuleSize为50，deepSplit为2，其他参数设置为默认值，并计算代特征向量值（ME），通过聚类合并具有高度相似的模块，便可得到基因模块。

其中，Bij表示基因i和基因j之间的邻接系数;lij表示基因i与基因i所有共同相邻基因的邻接系数的乘积之和;ki代表基因i与所有相邻节点的邻接系数综合。若值为0，表示这两个基因都是孤立的。若值是1，表示这两个基因与所有基因都是相邻的。

2.3筛选共表达网络关键模块

本文将使用两种方法来鉴别与高血压相关的模块。第一种方法，计算各模块的模块特征基因（module eigengene，ME）与疾病性状皮尔森相关系数及其P值来确定关键模块;第二种方法，通过计算基因显著性（Gene Significance，GS）和模块显著性（Module Significance，MS）来确定关键模块。GS是指基因的表达量与某一临床信息的皮尔森相关系数，MS是指模块中所有基因的GS的平均值。一般所有模块MS与GS的绝对值越大，说明与PAH疾病越相关。

2.4鉴定关键模块的枢纽基因

模块的枢纽基因是与疾病最紧密相关的基因，通常具有更大的生物学意义。Gs表示了基因在各种网络中的重要性，模块身份（Modularmembership，MM）用来衡量基因在模块内的重要性，基因之间的权重显著性p.weighted可以通过WGCNA包中的networkScrenningO函数计算得到。为了鉴定出更加可靠的关键基因，我们再次采用网络的最大集团度（MCC），如公式（3）。筛选关键模块中的枢纽基因，最后将两种方法的共同基因作为关键基因。

3结果

3.1芯片数据预处理

我们使用R软件和limma软件包对数据进行校正批处理、去除空探针及重复基因。根据映射的探针确定了每个基因的表达值，如果多个探针映射到同一基因，则最大值表达值用于表示该基因的表达水平。最后，获得了20359个基因的表达谱。对表达谱矩阵进行标准差（sD）排序，选取前5000个基因作为共表达网络构建的输人数据，进行聚类分析，发现去除离群样本GSM3290090。

3.2并加权共表达网络的构建

软阈值的选择是构建WGCNA的关键。我们对从1到20的阈值进行了网络拓扑分析，发现当B=6时，满足无标度网络条件。通过层次聚类将具有相似表达的基因分组为同一模块，同时将切割线MEDissThres设置为0.2来合并模块，鉴定了17个基因模块。

3.3确定关键基因模块

我们通过第一种方法得到从模块purple和pink与PAH相-关性系数分别为-0.77，0.64，其绝对值大于其他模块的相关系数（图1），且P值都小于0.01，因此推断这两个模块与PAH最相关，且分别与PAH在显著的负相关和正相关，即前者模块中的基因可能抑制PAH的发生，后者可能促进PAH的发生。为保证关键模块筛选的准确性，我们用另一种方法重新筛选关键模块，结果表明purple和pink模块的GS绝对值最大（图2）。用上述两种不同方法筛选结果相同，因此purple和pink模块为关键模块。

3.4与PAH发生相关的枢纽基因

在本研究中，首先以|MM|>0.8、|GS|>0.2和p.weighted<0.05为标准进行筛选，分别在purple和pink模块中筛选出了24个和21个枢纽基因。然后将关键模块基因文件导人Cyto-scape，通过MCC算法分别获得toplO枢纽基因，将两个方法获得基因取交集，最终在purple模块中确定了7个关键基因（TLR1，AQP9，SIGLEC9，LRRC25，LILRA6，LILRB3，S100A9），在pink模块中确定了5个关键基因（ANTXRl，UACA，ECM2，RBFOX2，NREP）。

4讨论

在这项研究中，我们使用WGCNA构建PAH的基因共表达网络，目的是寻找新的和关键的生物标志物。在WGCNA中，动态树切割共识别了17个基因模块，其中purple和pink模块是与PAH高度相关的两个模块。然后筛选了12个与PAH相关的潜在枢纽基因，即TLRl、AQP9、SIGLEC9、LRRC25、LILRA6、HLRB3、S100A9、ANTXRl、UACA、ECM2、RBFOX2、NREP。其中，前七个关键基因与PAH呈负相关，可能抑制PAH的发生，后五个关键基因与PAH呈正相关，可能诱发PAH的发生。

通过查询文献及基因数据库，发现有三个关键基因（TLRl、AQP9和RBFOX21已经有研究表明与PAH或高血压相关，如Koupenova M等人发现不同性别的血小板TLR转录物与不同的心血管危险因素和循环炎症水平相关;AQP9在内皮细胞，血管平滑肌细胞和心血管系统心脏中表达，参与心血管功能和相关疾病的病理过程;Zhou Y等人研究发现RBFOX2在高血压中起关键作用。有四个关键（sIGLEC9、ANTXRl、LRRC25和ECM21虽然还未有报道其与PAH相关，但其对血管具有调节作用或与TGT-β相关。其余五个关键基因（LILRA6、LILRB3、S100A9、UACA和NREPl调控参与肿瘤的免疫反应、胰岛素抵抗/2糖尿病、调节细胞凋亡、肾纤维化的新靶标等。表明我们的研究可以筛选出具有生物学意义的PAH关键基因。这些发现有助于更好地了解PAH的发病的机制，为临床决策提供预后生物标志物。