阿尔兹海默症血清多肽组生物标志物研究

孔祥怡++杜建时++马明++徐金玲++李水明++王勇++赵晴

摘要 采用个体样品单独分析的方式分析， 比较9个健康对照者、10个阿尔兹海默症（Alzheimer′s disease， AD）患者和12个认知功能障碍（Mild cognitive impairment， MCI）患者的血清多肽组分析结果， 以寻找潜在的AD病生物标志物。结果表明， 高强度的α2巨球蛋白肽段VGFYEDVMGR与AD病晚期阶段密切相关， 而载脂蛋白 CⅢ、组蛋白12和组蛋白14的大量降解， 则与中早期AD和认知功能障碍相关联；载脂蛋白 CⅢ和组蛋白1的降解肽段具有明显的阶梯序列特征， 但在不同样本中的分布具有一定偶然性。AD病发展的晚期与中早期的血清多肽组特征不同， 这4种蛋白质的降解有可能成为AD病潜在的生物标志物。研究结果也证明了， 归属于纤维蛋白原α链、胸腺素β4和斑联蛋白等蛋白质的肽段是所有血清样本中的优势肽段。本研究提出了利用血清多肽组学方法辅助诊断AD病的方法， 为临床大规模验证提供了依据和参考。

关键词 多肽组；生物标志物；血清；阿尔兹海默症；认知功能障碍

1引 言

阿尔兹海默症（Alzheimer′s disease， AD）是一種与年龄相关的神经退行性疾病， AD病目前尚无法治愈和逆转， 早期干预和诊断是延缓AD发生的重要途径＼[1＼]。神经心理学量表测试、影像学检查和生物标志物检测是诊断AD病的3种主要方法＼[2＼]。生物标志物是能够预测或反映特定生物过程变化的物质＼[3＼]， 目前公认的AD病生物标志物是脑脊液（CF）中淀粉样蛋白Aβ42水平的下降和磷酸化tau蛋白水平的升高＼[4＼]。但是， 脑脊液检测是有损分析， 作为一种常规性检测很难普及， 而在血液、唾液和尿液等体液中寻找AD病的生物标志物， 具有取样方便和无创伤性的优点， 其中以血液在临床上最为常用。

Lista等＼[5＼]对基于质谱的AD病血液生物标志物进行了综述， 汇总了约20种蛋白质的含量改变和氧化应激可成为AD病的生物标志物， 并强调AD等神经退行性疾病的分子水平上的改变在出现临床症状的20年以前就可能发生。血液中tau 蛋白和Aβ42的含量很低， 不是理想的AD标志物， 但炎症和免疫相关蛋白质与AD病关系密切＼[6＼]。在前期工作中， 本研究组利用iRAQ定量标签技术对比AD病患者和年龄匹配对照组血清中的蛋白质， 发现了100A8等25种差异表达蛋白， 有可能成为潜在的AD血液生物标志物＼[7＼]。血液中磷脂类等小分子化合物也被用来预测AD病＼[8＼]。O′Bryant等＼[9＼]指出， 基于血液的AD生物标志物在过去十余年取得了显著进展， 分析时间降低， 可接受性增强， 但重复性较差和缺少不同实验室之间的交叉验证制约了研究成果向医学临床的转化。尽管血液中多种蛋白质被认为有望成为AD病生物标志物， 但目前尚未见AD病多肽组生物标志物的相关报道。

氧化石墨烯磷酸镧纳米磁性复合材料（LaGM）由石墨烯、LaPO4纳米棒和Fe3O4纳米粒子构成， 可快速富集生物样品中的低丰度多肽＼[10＼]。在前期研究中， 本研究组利用该材料分离多肽， 建立了纳升液相色谱高分辨串联质谱分析的血清多肽组鉴定方法＼[11＼]。本研究采用单个样本逐一分析的方式， 通过对比AD组、认知功能障碍组（Mild congnitive impairment， MCI）和健康对照组血清多肽组结果的差异， 从蛋白质异常降解的角度寻找潜在的AD病标志物， 为临床诊断和药效跟踪等提供参考。

2实验部分

21仪器与试剂

Eksigent nanoLCUltraM 2D 纳升液相色谱系统、riple OF 5600 plus高分辨质谱仪、Protein Pilot 45软件（美国AB CIEX公司）；真空冷冻干燥机（美国hermo avant公司）。

纳升液相色谱流动相 A为01% 甲酸2% 乙腈， 流动相 B为01% 甲酸98%（V/V）乙腈；C18反相色谱捕集柱（100 μm × 3 cm， 3 μm， 150 ）、C18反相色谱分析柱（75 μm ×15 cm， 3 μm， 120 ， ChromXP Eksigent， 美国ciex公司）。所用试剂均为分析纯或质谱纯， 购于美国hermo公司。氧化石墨烯磷酸镧纳米磁性复合材料（LaGM）根据文献＼[10＼]自行合成。所有临床样品来自吉林大学中日联谊医院， 符合人体样品使用要求， 患者知情同意。

22多肽的分离和富集

血清样本共31例， 每例取80 μL人血清样品， 加入 500 μL去离子水， 与20 μL 30 mg/mL LaGM 复合材料混合， 1000 r/min振荡10 min， 磁分离， 在沉淀中加入500 μL 水， 涡旋1 min， 振荡5 min， 磁分离去掉上清液。在沉淀中加入20 μL 80% 乙腈+1% FA（V/V）的洗脱液， 涡旋1 min， 振荡5 min， 磁分离， 收集上清液， 冷冻干燥。

23反相色谱riple OF质谱分析

将分离冻干的多肽样品溶解于流动相A中， 在Eksigent nanoLCUltraM 2D系统上进行色谱分析。样品溶液以2 μL/min的流速上样到C18预柱（100 μm × 3 cm， 3 μm， 150 ）， 然后保持流速冲洗脱盐10 min。分析柱是C18反相色谱柱（75 μm × 15 cm， 3 μm， 120 ， ChromXP Eksigent）， 梯度洗脱： 70 min内流动相B由5%升高至80% （V/V）。质谱分析采用ripleOF 5600系统结合纳升喷雾Ⅲ离子源（AB CIEX， UA）， 喷雾电压为24 kV， 气帘气压为02 Mpa， 雾化气压为34 kPa， 加热温度为150℃， 质谱扫描方式为数据依赖采集模式。

24数据分析条件

质谱采集到的原始wiff图谱文件， 采用Protein Pilot oftware v 45（AB CIEX， UA）软件进行数据加工处理和检索分析， 数据库为Uniprot库中的omo sapiens人种专一数据库（包含20210条蛋白质序列， 2015年1月2日下载）， 检索参数设置为非酶切， 检索方式为彻底分析， 假阳性率控制为1% FDR。

3结果与讨论

31血清多肽组的个体差异及共同特征

相比于串联飞行时间质谱技术， 高分辨的四极杆飞行时间串联质谱的碰撞能更高， 更易于鉴定非特异性酶切的肽段序列。例如， 纤维蛋白原α链的肽段FEKYKMADEAGEADEGKRGA由29个氨基酸构成， 但在本实验中得到了几乎互补连续的y、b离子序列， 还观察到了苯丙氨酸、组氨酸和谷氨酸的亚胺离子m/z 12008， m/z 11007和m/z 10208（图1）。

本研究共对9例健康对照者、10例AD病患者和12例认知功能障碍患者（MCI）的血清样品进行了多肽组成分分析， 结果如表1所示。对照组中肽段数目最少为212条， 归属于40个蛋白质， 最多则为归属于130个蛋白质的1195条肽段；在AD和MCI组中鉴定到的肽段数目最少分别为261和406条， 蛋白质数目最少分别为48和65个蛋白质。而在AD组样品中， 鑒定到的肽段数目最多为956条， 蛋白质数目最多为96个， 在MCI组中， 肽段和蛋白质数目最多分别为1095和123个。总体上， AD组和MCI组中的最高肽段数目约为最低数目的2倍， 而在9例健康对照组样品中， 鉴定到的肽段数目和蛋白质数目则分别相差6倍和3倍。这些结果说明， 血清多肽组的个体差异很大， 如果利用混合样品进行分析则不能发现这些差异。尽管如此， 来自于纤维蛋白原α链、胸腺素β4和斑联蛋白等蛋白质的肽段在所有个体血清样品中都为优势肽段， 与前期研究结果一致＼[10＼]， 例如， 纤维蛋白原α链在全部31个血清样本的28样本个中鉴定分值排在第一位， 在另外3个样本中排在第二位， 其特异性肽段的100条以上， 约占总检出肽段数目的15%～40%。

总体而言， 在血清样品中检测到的肽段数目与其所归属的蛋白质数目具有正相关性， 但个体差异仍然较大。例如， 在对照组样品6中鉴定到归属于86个蛋白质的593个肽段， 而在样本4中， 测到了760个肽段， 但对应的蛋白质仅有69个； 在MCI和AD组样品中也都存在蛋白质数目和肽段数目不是严格正相关的情况。健康对照组和AD组所检出的平均肽段数目约为550条， 对应75种蛋白质， 而在MCI组中， 平均肽段和蛋白质数目则分别为710和88。以上结果表明， 无论是疾病组， 还是健康对照组样品， 血清多肽组的鉴定数目都存在一定差异， 这是因为即使不考虑相同序列肽段的强度差异， 在定性分析的结果上也必然存在差异。既然在两个对照组结果之间都存在差异， 可以推测， 不是一组对照组和疾病组样品之间所有的多肽组差异都可作为潜在的生物标志物。例如， 存在大量阶梯序列是血清多肽组的一个显著特征， 这些肽段的结构具有相似性， 但它们在不同个体样本中的分布具有随机性。例如， 在对照组样品1和2中， 含有序列KMADEAGEADEGKRGA的相同肽段有43条， 而含有该序列的不同肽段在样品1中有6个， 在样品2中有7个。同理， 随机比较对照样本1和AD样本6的分析结果发现， 两个样本中也有10条共同肽段含有序列KMADEAGEADEGKRGA。因此， 比较两个不同样本的正常多肽组分析结果， 通常能找到一些相同肽段和不同肽段， 相同肽段在纤维蛋白原α链、胸腺素β4和斑联蛋白等优势蛋白中出现几率更高。另一方面， 此结果也提示在寻找多肽组生物标志物时， 应尽量降低偶然因素的影响。在以上31个样本中， 归属于纤维蛋白原α链的肽段在单个样本中可测定到50条以上， 最多则接近300条。Noguchi等＼[12＼]从30例AD病患者和30例健康对照样本血清中检测到了157条总肽段， 根据离子强度分析， 发现其中60个肽段有强度差异， 但只鉴定了包括10条归属于纤维蛋白原α链的肽段在内的16条肽段的序列， 并据此认为一些定量强度在13倍以内的纤维蛋白原α链可以作为AD病生物标志物。但该研究未考虑其分析方法的局限性。

32蛋白质水平上血清多肽组标志物

前期结果表明， 如果不同样品中同一蛋白或肽段的离子强度相差超过3 倍， 则可认为其含量具有差异＼[13＼]， 本研究综合考虑相对定量和定性分析结果的差异， 利用离子强度和检出肽段数目两种指标衡量不同样本血清多肽组结果的差异， 寻找潜在的AD病和认知功能障碍（MCI）生物标志物。结果表明， 载脂蛋白 CⅢ、α2巨球（A2M）蛋白、组蛋白12和组蛋白14在对照组和疾病组之间具有明显差异， 它们的相对含量（离子强度）和肽段检出数目的增加有可能成为潜在的生物标志物， 结果如表2所示。为了说明个体差异对结果的影响， 表2还列出了各个体样本的血清多肽组的总离子强度和这4种蛋白质的肽段检出数目。健康对照组、AD组和MCI组的总离子强度平均值分别为14×106， 24×106和24×106。在9个对照组血清样本中， 载脂蛋白CⅢ等四种蛋白质的总离子强度普遍偏低， 总离子强度大多低于10×104， 例外的是对照5样本中组蛋白14的总离子强度为21×104， 可能是因为个体差异所致。

α2巨球（A2M）蛋白在AD病理学中具有重要作用， 与AD相关的A2M基因的DNA多态性导致AD脑中淀粉样斑块的积累显着增加＼[14＼]；也有研究表明， 血液中的A2M浓度与脑脊液中神经元损伤标志物的浓度相关， 较高的基线血清A2M浓度增加了男性患AD病的几率＼[15＼]。在10例AD病人的血清样本中， 有6例α2巨球蛋白的离子强度显著增加， 而其它3种蛋白质的强度无明显变化。值得注意的是， 以上6例AD病人的发病时间均超过4年， 智力减退症状和情感障碍已很明显， 临床上已不难诊断。因此， 寻找早期的认知功能障碍（MCI）阶段的生物标志物更有意义。在其余的4例AD病和13例MCI血清样本中， 有10例样本的载脂蛋白CⅢ的总离子强度和肽段检出数目显著增加， 有14例伴随着组蛋白12和组蛋白14的肽段检出数目和离子强度的显著增加。有研究指出， 血浆中低水平的载脂蛋白CⅢ会增加AD病风险， 是AD病的早期标志物， 认为该蛋白因结合β淀粉样蛋白Aβ结合蛋白而含量降低＼[16＼]。但本研究结果表明， 载脂蛋白CⅢ蛋白质水平上含量的降低也可能由于其降解所致。组蛋白的去乙酰化与AD病发病机理密切相关， 但组蛋白的降解与AD通过何种方式联系目前尚不知晓。尽管如此， 本研究结果表明， 组蛋白12和14的降解是伴随MCI和发病时间较短的AD病的大概率事件， 可能与AD病的发生发展过程相联系， 但是在晚期AD病血清中很少能检测到， 推测该蛋白的降解是人体的应激反应， 发病时间过长， 组蛋白降解的应激反应减弱， 但与α2巨球蛋白降解相关的应激反应加强增加。

33肽段水平上血清多肽組标志物的多样性

通常， 根据不同样品中相同肽段的强度差异或者有和无的区别可以确定潜在的肽段标志物， 但是在实际样品中情况较为复杂。分别以载脂蛋白CⅢ和α2巨球蛋白为例进行说明。在多肽组分析结果中， 蛋白质总离子强度增加常伴随检出肽段数目的显著增加。例如，在第10例AD病血清样本中， 检测到了36条归属于载脂蛋白CⅢ的肽段， 其中17条肽段列于表3， 这17条肽段可视为以肽段PEVRPAVAA和EAEDALLFMQGYMKAKA为基础延伸出的两类阶梯序列。在一些对照组样品中， 能检测到肽段PEVRPAVAA或EAEDALLFMQGYMKA的类似阶梯肽段， 但肽段数目通常较少， 而强度差别有时并不明显， 即疾病组中载脂蛋白CⅢ强度的增加部分来自于检出肽段的增加。实际上， 肽段的出现具有偶然性， 例如在有些AD样本中检测到的该系列的最短肽段为EAEDALLF， 而最长肽段为EAEDALLFMQGYMKAKAKDALVQEQVAQQA， 因此， 由于个体差异和肽段的多样性， 以载脂蛋白CⅢ的降解增加做为生物标志物， 比某一特定肽段为潜在生物标志物更为稳健。

相比之下， α2巨球蛋白的肽段分布情况简单得多。尽管其是血浆中分子量最大的蛋白质， 但检出的肽段数目最多5条， 很多情况下为1条（结果见表2）， 并且均为VGFYEDVMGR， 而其它肽段均与该肽段大部分序列相同， 包括VGFYEDVM （oxidation）GR、FYEDVMGR、GPEGLRVGFYEDVMG、GFYEDVMGR和GPEGLRVGFYE等， 但它们的检出数目较少， 并且离子强度低于该肽段一个数量级以上。因此， 可以认为α2巨球蛋白的最主要肽段是VGFYEDVMGR， 6名晚期AD患者α2巨球蛋白的总离子强度较高， 均是因为该肽段强度高所致。组蛋白12和14的肽段分布情况也较为复杂， 不像α2巨球蛋白一样具有很强的规律性。组蛋白12和14在健康对照组血清样本中的强度普遍较低， 而在所有MCI样本和2例AD病血清中离子强度很高， 这可能与组蛋白1的功能相关。文献＼[17＼]表明， 成年人大脑损伤后， 会向细胞外释放组蛋白1， 而组蛋白1可通过线粒体损伤和凋亡来杀死神经元， 进而造成进一步的脑损伤和智力行为变化， 释放出的组蛋白在体内降解后释放入血液从而被检测。由于组蛋白的释放属于脑损伤的应激反应， 因此， 在正常人血液中组蛋白肽段含量较低。 AD病的一个明显特征是脑内能量代谢的障碍， 在晚期AD病人体内与组蛋白释放相关的应激反应减弱， 几乎检测不到组蛋白1的降解肽段。因此， 组蛋白12和14有可能将MCI和晚期AD相区别， 并结合其它指标用于AD病的临床前诊断。

4结 论

本研究发现α2巨球蛋白肽段VGFYEDVMGR与AD病的晚期阶段密切相关， 而载脂蛋白CⅢ、组蛋白12和组蛋白14的大量降解与早期AD和认知功能障碍存在关联。个体样品的分析结果表明， 生物标志物的多肽组特征与临床诊断结果之间可能并不完全一致， 例如， 部分AD病人的血浆多肽组学特征更接近MCI， 这可能是由于病人的智力表现与病理生理变化不完全同步所致。本研究进一步验证了个体血清多肽组结果的差异性和共性， 证明纤维蛋白原α链、斑联蛋白和胸腺素等蛋白质的肽段为血清中的优势肽段。

References

1elkoe D J cience， 2012， 337： 1488-1491

2Perrin R J， Fagan A M， oltzman D M Nature， 2009， 461： 916-922

3Fagan A M， Xiong C J， Jasielec M ， Bateman R J， Goate A M， Benzinger L ci ransl Med， 2014， 226： 226-230

4Duits F ， Prins N D， Lemstraa A W， Pijnenburga Y A L， Bouwmana F ， eunissenb C E Alzheimers Dement， 2015， 11： 523-532

5Lista ， Faltraco F， Prvulovic D， ampel Prog Neurobiol， 2013， 101102： 1-17

6BIE LiZhan， NI Xiuhi Modern Journal of Integrated raditional Chinese and Western Medicine， 2014， 23（34）： 3867-3871

别立展， 倪秀石 现代中西医结合杂志， 2014 ， 23（34）： 3867-3871

7hen L， Liao L L， Chen C， Guo Y， ong D L， Wang Y， Chen Y， Zhang K， Ying M， Li M， Liu Q， Ni J J Alzheimers Dis， 2017， 56（1）： 361-378

8 Mapstone M， Cheema A K， Fiandaca M ， Zhong X， Mhyre R， MacArthur L ， all W J， Fisher G Nat Med， 2014， 20（4）： 415-418

9O′Bryant E， Mielke M M， Rissman R A， Lista ， Vanderstichele ， Zetterberg ， Lewczuk P， Posner Alzheimers Dement， 2017， 13（1）： 45-58

10Cheng G， Wang Z G， Liu Y L， Zhang J L， un D ， Ni J Z Chem Commun， 2012， 48（82）： 10240-10242

11KONG XiangYi， I Kai， CONG LeLe， WANG Jing， JIANG LiJun， ONG XiaoYu， LI huiMing， WANG Yong， ZAO Qing Chinese J Anal Chem， 2017， 45（1）： 133-138

孔祥怡， 石 鍇， 丛乐乐， 王 静， 蒋立军， 洪晓愉， 李水明， 王 勇， 赵 晴 分析化学， 2017， 45（1）： 133-138

12Noguchi M， ato ， Nagai K， Utagawa I， uzuki I， Arito M， Iizuka N， uematsu N， Okamoto K， Kato ， Yamaguchi N， Kurokawa M Int J Geriatr Psychiatry， 2014 ， 29（8）： 808-818

13ONG XiaoYu， WANG ao， XU JinLing， LI huiMing， WANG Yong. Chinese J Anal Chem， 2016， 44（3）： 403-408

洪晓愉， 王 浩， 徐金玲， 李水明， 王 勇 分析化学， 2016， 44（3）： 403-408

14Kovacs D M Exp Gerontol， 2000， 35（4）： 473-479

15Varma V R， Varma ， An Y， ohman J， eddighi ， Casanova R， Beri A， Dammer E B， eyfried N ， Pletnikova O， Moghekar A， Wilson M R， Lah J J， O′Brien R J， Levey A I， roncoso J C， Albert M ， hambisetty M Mol Psychiatry， 2017， 22（1）： 13-23

16hih Y ， sai K J， Lee C W， hiesh C， Chen W ， Pai M C， Kuo Y M J Alzheimers Dis， 2014， 41（3）： 855-865

17Gilthorpe J D， Oozeer F， Nash J， Calvo M， Bennett D L， Lumsden A， Pini A F1000Res， 2013， 8（2）： 148