刺芒柄花素对Ⅱ型糖尿病大鼠骨质疏松的缓解作用

侯 伟, 万 趸

(四川省骨科医院脊柱科, 成都 610041)

Ⅱ型糖尿病是一种以代谢失衡为特征的疾病，常常伴有多种并发症，其中骨质疏松已被多数学者公认。骨质疏松是一种以骨结构遭到破坏，导致骨量降低，使骨组织脆性变强的全身性骨代谢疾病，以绝经后女性和老年人多见。目前研究[1]认为，骨质疏松发病机制主要是由骨吸收与骨形成发生障碍引起，其病理现象主要是成骨细胞功能的紊乱，以及破骨细胞吸收的增强。但针对Ⅱ型糖尿病并发骨质疏松尚未找到有效的治疗药物。刺芒柄花素(formononetin)是红车轴草的主要有效成分，属于异黄酮类成分。研究[2]证实，红车轴草中异黄酮类植物成分表现为类雌激素样作用。

刺芒柄花素具有多种药理活性，如抑制肿瘤、抗氧化、抗高血压及雌激素样作用，其对骨质疏松有预防治疗的作用，但其是否对Ⅱ型糖尿病并发糖尿病骨病大鼠的骨质疏松具有缓解作用，以及是否对骨组织形态存在影响，目前尚未有研究证明。因此，本研究旨在探究刺芒柄花素对Ⅱ型糖尿病并发糖尿病骨病大鼠骨质疏松的缓解作用及骨组织形态的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD 大鼠60 只，体质量270~290 g，9 周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2019-0001]，饲养于四川省骨科医院动物研究所[SYXK(川)2018-058]。动物实验经本单位动物福利伦理委员会批准(批号：20180506)。

1.2 试剂和仪器

刺芒柄花素粉末(陕西慈缘生物技术有限公司)；睾酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol,E2)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；TRIzol总RNA 提取试剂(北京艾德莱生物科技有限公司)；HiScript 反转录酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)；兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司)；山羊多抗CYP24A1(美国Novus 公司)；兔多抗骨钙素(osteocalcin, OC)(北京博奥森生物技术有限公司)。

三诺血糖仪(长沙三诺生物传感技术有限公司)；RT-2100C 自动酶标仪(赛默飞世尔科技公司)；MDF-382E 型超低温冰箱(日本Sanyo 公司)；1-15K 型冷冻离心机(上海天美科学仪器有限公司)；9700 型Gene AmpPCR 仪(应用生物系统公司)；Discovery-A 型双能X 线吸收骨密度仪(美国Hologic 公司)。

1.3 造模及分组

60 只大鼠，随机取10 只作为对照组，普通饲料喂养；另50 只大鼠进行Ⅱ型糖尿病造模，具体方法是用高脂饲料(high fat diet, HFD)喂养。HFD 热量为21.35 kJ/g，其中来自脂肪的热量占61.6%，蛋白质占18.1%，碳水化合物占20.3%(Test Diet，Richmond，IN，美国)。HFD 连续喂养4 周后，腹膜内注射低剂量的链脲佐菌素(STZ)(35 mg/kg)。继续HFD 喂养1 周后，禁食12 h，使用市售的血糖仪测量大鼠空腹血糖水平，血糖水平≥16.7 mmol/L 即造模成功[3]。

50 只大鼠，造模成功45 只，造模成功率为90%。将造模成功的45 只大鼠随机抽取15 只作为糖尿病组；另30 只作为给药组，随机分为刺芒柄花素高、中、低剂量组(100 mg/kg、50 mg/kg,20 mg/kg)，每组10 只，每日1 次给予相应剂量的刺芒柄花素；对照组及糖尿病组给予相应体积的蒸馏水，连续灌胃4 周。

1.4 取材

大鼠经麻醉后股动脉取血，静置于分离胶促凝管中30 min 后，3 000 r/min 4 ℃低温离心10 min，收集血清，-80 ℃保存；处死大鼠后，摘取大鼠肾脏，并迅速剔出各组大鼠大腿双侧股骨；将股骨周围多余的软组织去除，左侧病灶区股骨迅速放进液氮中，3 min 取出；用生理盐水纱布将右侧股骨包好，在-80 ℃ 冰箱保存备用。

1.5 股骨骨密度(BMD)检测

造模成功4 周末，采用双能X 线吸收法检测各组大鼠股骨BMD，扫描软件为小动物软件(版本：3.9.4)，测量条件：扫描速度60 mm/s，测定面积0.24 cm2。

1.6 ELISA 检测大鼠血清T、E2 水平

根据试剂盒说明书，检测大鼠血清T、E2水平。在96 孔酶标板内进行操作，经过显色后在酶标仪内以450 nm 波长依序测量各孔内吸光度值，并计算标准曲线的回归方程式，求得样品浓度。

1.7 PCR 检测

TRIzol 法提取股骨以及肾脏RNA，取溶解后的RNA 2 µL，用微量分光光度计测定A260与A280比值为1.8~2，即满足实验要求，然后计算样品RNA 浓度。在RNA 反转录酶及RNA 酶抑制剂的作用下，以Oligo(dT)为引物将总RNA 反转录为cDNA，反转录条件为25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。反转录完毕后，将cDNA 静置于-80 ℃冰箱备用。以GAPDH 为内参基因，进行实时荧光定量PCR 扩增检测样本中OC 及 CYP24A1 mRNA表达。扩增引物由武汉擎科公司合成，引物序列见表1。PCR 扩增条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，40 次循环。每个样品设置3 个复孔，绘制溶解曲线。

1.8 统计学处理

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 结果

2.1 刺芒柄花素对大鼠股骨BMD 的影响

与对照组大鼠比较，糖尿病组大鼠的BMD降低(P<0.05)；与糖尿病组比较，刺芒柄花素低、中、高剂量组大鼠BMD 均升高(P<0.05)(图1)。

图1 各组大鼠骨密度Figure 1 Bone mineral density of rats in each group

2.2 刺芒柄花素对大鼠血清T、E2 水平的影响

ELISA 结果显示，与对照组比较，糖尿病组T、E2水平明显下降(P<0.05)；与糖尿病组比较，刺芒柄花素各组T、E2水平明显上升(P<0.05)(表2)。

2.3 刺芒柄花素对大鼠股骨OC mRNA、肾脏CYP24A1 mRNA表达的影响

结果显示，与对照组比较，糖尿病组股骨OC mRNA、肾脏CYP24A1 mRNA表达显著上调(P<0.05)；与糖尿病组比较，刺芒柄花素各组OC mRNA、CYP24A1 mRNA表达均显著下调(P<0.05)(表3)。

表2 刺芒柄花素对大鼠血清 T、E2 水平的影响Table 2 Effect of formononetin on serum T and E2 levels in rats (, n=10)

表2 刺芒柄花素对大鼠血清 T、E2 水平的影响Table 2 Effect of formononetin on serum T and E2 levels in rats (, n=10)

注: 与对照组比较, *P<0.05; 与糖尿病组比较, #P<0.05。

组 别 Tρ/(ng·mL-1) E2ρ/(pg·mL-1)对照组糖尿病组刺芒柄花素低剂量组刺芒柄花素中剂量组0.33±0.07 0.12±0.03*0.16±0.04#0.24±0.06#0.31±0.09#63.12±0.26 50.33±0.47*52.72±0.33#55.81±0.29#59.22±0.87#刺芒柄花素高剂量组

表3 刺芒柄花素对大鼠股骨OC mRNA、肾脏 CYP24A1 mRNA表达的影响Table 3 Effect of formononetin on the expressions of OC mRNA in femur and CYP24A1 mRNA in kidney of rats (, n=10)

表3 刺芒柄花素对大鼠股骨OC mRNA、肾脏 CYP24A1 mRNA表达的影响Table 3 Effect of formononetin on the expressions of OC mRNA in femur and CYP24A1 mRNA in kidney of rats (, n=10)

注: 与对照组比较, *P<0.05; 与糖尿病组比较, #P<0.05。

组 别 OC CYP24A1对照组糖尿病组刺芒柄花素低剂量组刺芒柄花素中剂量组1.03±0.17 3.17±0.22*2.93±0.29#2.18±0.16#1.12±0.21#1.07±0.15 2.39±0.19*2.15±0.28#1.88±0.23#1.21±0.13#刺芒柄花素高剂量组

3 讨论

糖尿病易导致微血管病变和骨并发症，其骨并发症主要以骨质疏松为主要表现，易导致骨折，甚至致死致残，严重影响患者生活和生存质量。Schwartz 等[4]研究显示，Ⅱ型糖尿病患者中骨质疏松人数占20%~60%。研究[5]表明，维生素D、性激素和OC 均与骨质疏松存在密切关联。其中，人体内维生素D 代谢的主要限速酶是25OHD-1α 羟化酶 D，它能够加速1,25(OH)2D3 在体内的代谢过程，降低机体的维生素D 水平[6]。而维生素D 缺乏会引起雌激素分泌紊乱[7]。动物实验[8]表明，维生素D 缺乏模型小鼠伴有T、E2、促黄体生成素等性激素水平的紊乱。性激素分泌紊乱会影响机体内成骨细胞与破骨细胞间的平衡，进而诱发骨质疏松症。中医学认为，骨质疏松症属于“骨萎”、“骨痹”的范畴，发病原因多与气血津液不足、脾胃运化失调、肾中精气亏虚以及体虚劳倦过度有关[9]。临床观察[10]表明，骨质疏松症肾虚量化评分与血清E2水平存在明显的负相关。O C 是一种由成骨细胞分泌合成，具有生物学活性的多肽，为衡量成骨细胞活跃程度的重要指标之一，受维生素D 及维生素K水平等因素的调控。有学者[11]提示，OC 不仅能清晰地反映患者的骨代谢情况，还能完整地评价药物对骨质疏松症的治疗作用。去势骨质疏松大鼠接受槲皮素治疗4 个月后，骨质疏松情况好转，血清OC 水平显著下降[12]。国内另外一项金天格胶囊对绝经后骨质疏松大鼠的研究[13]也佐证了此观点。

研究[14]发现，Ⅱ型糖尿病患者的骨量减少，BMD 下降。本实验中，模型组大鼠BMD 显著下降，而刺芒柄花素能够改善Ⅱ型糖尿病并发骨质疏松大鼠的BMD，升高血清T、E2水平，抑制骨OC mRNA表达。这可能与当归补血汤降低维生素D 限速酶CYP24A1 mRNA 的表达水平，维持机体内维生素D 水平有关。

综上，刺芒柄花素可能是通过影响维生素D限速酶CYP24A1表达，干预 OC 及性激素水平，从而实现对骨质疏松的治疗作用，但其具体的分子作用机制需进一步研究。