池塘沉积物对上覆水脱氮作用的初步探究

2020-07-04付贤茂罗国芝刘文畅谭洪新

渔业现代化 2020年3期

付贤茂，罗国芝,2,3，刘文畅，谭洪新,2,3

(1 上海海洋大学，上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306；2上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点试验室，上海 201306；3上海海洋大学，水产科学国家级试验教学示范中心，上海 201306)

氮循环是水产养殖生态系统物质循环的一个重要组成部分。养殖活动中，饲料等输入的氮量占整个养殖系统总氮输入量的90%[1]。但其中只有不到25%的氮被养殖对象转化到体内，大约有30%总氮(TN)以残饲、粪便形式进入池塘水体或沉积物中[2]。沉积物作为养殖池塘氮和其他元素的集中地，脱氮生物群落在其中扮演着重要角色[3]。沉积物不但能够吸附水体中的氮、磷、硫等元素，调节水体水质状况，而且是益生菌以及底栖生物生长繁殖的场所。但是沉积物积累会逐渐败坏水质、释放硫化氢等有毒物质[4-5]。一般采用晒塘和挖掘方法去除沉积物和污染物，但是这种方式无法避免更深层的氮素再矿化，挖掘出来的沉积物也会对环境造成污染[6]。因此，基于生物脱氮的原位修复方法可能更安全和更经济[7]。

以碱度为调控因子，研究池塘沉积物上覆水的脱氮效果和微生物群落，初步分析其脱氮规律以及微生物特性。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

1.2 试验沉积物反应器设置

采用12个室内玻璃纤维反应器(直径30 cm，高50 cm，工作体积15 L)开展试验，设置A组(对照组)、B组、C组、D组，每组3个重复。每个容器接种10 cm搅拌均匀的沉积物样品。试验废水采用人工配水[13]，并通入N2使溶氧达到1.5～2.0 mg/L。为避免搅动沉积物，使用虹吸法向每个反应器加入2 L人工配水。反应器用锡箔纸密封避光，试验用小苏打(NaHCO3)调控碱度，各组投加量：A组0 mg/L，B组300 mg/L，C组500 mg/L，D组700 mg/L；初始碱度(以CaCO3计)分别为(143.3±7.10)mg/L、(275.2±22.01)mg/L、(385.1±28.01)mg/L和(466.5±61.50)mg/L。

1.3 检测方法

R=(C1-C2)/C1×100%

(1)

总DNA提取及PCR扩增：使用DNA提取试剂盒从样本中提取DNA，使用 Qubit© dsDNA HS Assay Kit检测。以 20～30 ng DNA为模板，使用PCR引物扩增原核生物16SrDNA上包括V3及V4的2个高度可变区。上游引物序列为(CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT)，下游引物为(GGACTACNVGGGTWTCTAATCC),PCR扩增体系(25 μL)TransStart Buffer2.5 μL，dNTPs.2 μL，primers.1 μL × 2，TransStart Taq DNA 0.5 μL，模板DNA 20 ng，ddH2O补至总体积25 μL。PCR 反应参数：预变性参数94 ℃ 3 min × 1，变性参数94°C 5 sec，退火参数 57 ℃ 90 sec，延伸72 ℃ 10 s，终延伸参数72 ℃ 5 min，共进行24个循环。

高通量测序：采用Illumina MiSeq测序系统对采集的底泥样品进行高通量测序。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 上覆水脱氮作用的影响

表1 试验期间沉积物水处理效果

图1 试验期间总氮(a)、氨氮(b)、亚硝酸盐氮(c)及硝酸盐氮(d)的动态变化

试验期间碱度变化如图2所示。A组试验过程中碱度维持稳定，但是B、C和D组碱度均呈下降趋势，最终分别降至(160.66±17.70)mg/L、(191.53±25.09)mg/L和(226.89±20.23)mg/L。

图2 试验期间各组碱度动态变化

2.2 沉积物微生物群落动态分析

高通量测序鉴定出门水平微生物群落相对丰度如图3所示。

图3 初始沉积物组与试验组优势菌群在门水平上的分布

初始沉积物与试验组系统中主要是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和Epsilonbacteraeota。其中，变形菌门(68.1%±2.95%)丰度相对较高，占主导地位。而经试验驯化绿弯菌门与酸杆菌门相对丰度降低，分别从初始相对丰度9.48%，5.27%降低至5.7%，2.58%。硝化螺旋菌门随着试验时间的增加，其相对丰度也随之增加。但试验组与对照组微生物群落之间无明显差异(P>0.05)，而与初始沉积物有显著性差异(P<0.05)，这可能是因为试验环境与池塘环境略有不同导致。

图4所示为沉积物属水平微生物相对丰度，其中硫杆菌(Thiobacillus)、(f__Steroidobacteraceae_Unclassified)和硫碱螺旋菌属(Thioalkalispira)为主要优势菌属。未鉴别菌属(Unclassified)相对丰度比例为10.77%～11.07%。其中硫杆菌(Thiobacillus)和Sulfurimonas是一类常见的自养型脱氮硫杆菌，主要与硫自养反硝化有关。值得注意的是，在试验组中发现了硫碱螺旋杆菌属(Thioalkalispira)(5.6%)，其相对丰度比初始沉积物(0.4%)较高。f__Steroidobacteraceae_Unclassified(12.6%)在初始沉积物中占主要优势菌种，但试验组在驯化其相对丰度显著下降至4.3%。