靶向MSTN基因shRNA表达载体的构建与鉴定

王丽俊 钮利喜

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)，简称抑肌素，又名生长分化因子8(GDF-8)，是TGF-β超家族成员之一，其功能主要是作为一种骨骼肌生长的负调控因子，限制肌肉超常发育[1]。该基因的缺失或突变会使肌细胞增生和肥大，机体表现为双肌性状[2,3]。对MSTN基因的深入研究在畜牧业及医学领域具有重要意义。近年来，研究发现MSTN不仅可调控肌肉生长发育，在肌肉稳态中起关键作用，而且还影响脂肪形成和骨骼发育，并与胰岛素敏感度有关[4～6]。因此，有关MSTN基因与多种疾病的关系及其在机体代谢中的作用受到广泛关注。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象[7]。该技术可以简便、快速、高效、特异性地抑制基因的表达，因此受到了各个领域研究者的重视。该技术主要应用于探查基因功能、基因和转录调控研究等领域。本研究旨在构建具有良好干扰效果的pSIREN-MSTN-shRNA表达载体，为后续通过RNA干扰技术调控MSTN基因表达以改善和治疗MSTN相关疾病奠定基础。

材料与方法

1.主要试剂和实验材料：限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ(1010S和1040S，日本TaKaRa公司)；T4 DNA连接酶(2011A，日本TaKaRa公司)；质粒小量提取试剂盒(D1100，北京索莱宝科技有限公司)；SYBR®Premix Ex Taq TMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(RR820A，日本TaKaRa公司)；GDF-8抗体(sc-134345，美国Santa Cruz公司)；GAPDH抗体(MB001，南京巴傲得生物科技有限公司)；m-lgGk BP-HRP二抗(sc-516102，美国Santa Cruz公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(D2500-01，美国Omega Bio-Tek公司)；通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)(RP1100，北京索莱宝科技有限公司)；RIPA组织/细胞裂解液(R0020，北京索莱宝科技有限公司)；shRNA序列合成、引物序列合成(深圳华大基因公司)。健康ICR小鼠购自山西医科大学动物实验中心，雄性，6～8周龄，20只。

2.MSTN shRNA序列的设计与合成：根据Genbank上已公布的小鼠MSTN基因的mRNA序列(NM_010834.3)，选用Invitrogen的BLOCK-iTTMRNAi Designer软件，在线设计siRNA序列并挑选出3条可能具有良好干扰效果的siRNA序列，设计成包含正义链、loop环、反义链、转录终止信号和酶切位点的shRNA寡核苷酸单链[8]。其序列详见表1。

3.pSIREN-MSTN-shRNA表达载体的构建：将设计合成的shRNA引物进行退火形成双链，同时使用限制性内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ对载体pSIREN-DNR-DsRed-Express进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收酶切产物，与退火产物相连接(T4 DNA 连接酶，16℃水浴过夜)。连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的固体LB平板上，37℃恒温培养。挑取阳性单菌落于5ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基中培养10～12h，提取质粒，送至上海生工生物工程有限公司进行测序，鉴定重组质粒。将构建好的质粒命名为pSIREN-M664、pSIREN-M791和pSIREN-M819。

表1 设计合成的shRNA序列

4.shRNA表达载体导入小鼠体内：将6～8周龄的小鼠随机分为4组：pSIREN-M664实验组、pSIREN-M791实验组和pSIREN-M819实验组及阴性对照组(NC组)。采用肌内注射的方法将重组质粒载体导入小鼠体内。取100μg去内毒素质粒载体稀释于200μl的PBS(pH 7.4)溶液中，吸入1ml注射器，并将稀释液注入小鼠右后腿肌肉[9,10]。注射3天后，采用断颈法处死小鼠，取其右后腿部肌肉组织，用于下一步实验。

5.qRT-PCR检测干扰后MSTN的mRNA表达水平：取各组小鼠肌肉组织，通过Trizol法提取总RNA，按照通用RT-PCR试剂盒说明书，将RNA反转录合成为cDNA，利用SYBR法的real-time PCR试剂盒，以GAPDH为内参基因，进行实时定量PCR反应。用于定量检测的MSTN引物序列和GAPDH的引物序列如下：MSTN-上游引物为AACCTTCCCAGGACCAGGAGAA；MSTN-下游引物为GGCTTCAAAATCGACCGTGAGG；GAPDH-上游引物为ATCACTGCCACCCAGAAGACTG；GAPDH-下游引物为ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG。qRT-PCR反应体系为25μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5μl、上下游引物(10μmol/L)各1μl、模板cDNA 2μl、ddH2O 8.5μl。每份样品重复3次，结果采用 2-ΔΔct法进行数据处理。

6.Western blot法检测干扰后MSTN的蛋白质表达：各组取一定量的小鼠肌肉组织，充分剪碎后置于1.5ml的无菌EP管中，按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入RIPA组织/细胞裂解液，混合均匀，冰浴30min后，12000r/min、4℃离心30min，上清液即为所提取的总蛋白。调节上样量至每孔60μg蛋白样品进行12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入GDF-8一抗工作液(1∶200稀释)和GAPDH一抗工作液(1∶10000稀释)孵育，4℃过夜。TBST漂洗3次，加入HRP标记的二抗工作液(1∶1000稀释)后37℃ 孵育1h。TBST漂洗3次，ECL显色。

7.统计学方法：运用Excel进行数据预处理。采用SPSS 19.0统计学软件进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.pSIREN-DNR-DsRed-Express载体的酶切：对载体pSIREN-DNR-DsRed-Express进行BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，酶切后的质粒载体条带大小正确(图1)。

图1 pSIREN-DNR-DsRed-Express载体的酶切结果M.DL5000 DNA Marker；1.未经酶切的载体;2.经过酶切的载体

2.pSIREN-MSTN-shRNA表达载体的鉴定：由于插入的shRNA片段较小，不能通过PCR法或酶切鉴定，因此，将构建好的重组质粒送往上海生工生物公司测序鉴定，测试报告中的插入序列与所设计的shRNA引物序列完全一致，表明pSIREN-MSTN-shRNA表达载体构建成功，可以用于后续的干扰实验。测序结果详见图2。

3.shRNA干扰后MSTN的mRNA表达水平检测：利用qRT-PCR法检测干扰后小鼠肌肉组织中的MSTN mRNA表达水平，其检测结果详见图3。从条形图中可以看出3个干扰RNA实验组MSTN mRNA表达都有所降低，pSIREN-NC组与其他各组MSTN mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.01)。干扰质粒组pSIR-M664、pSIR-M791和pSIR-M819与对照组中MSTN基因mRNA相对表达量比较，分别降低65%、61%和71%。

图3 MSTN的mRNA表达水平检测与pSIREN-NC组比较，*P<0.01

4.免疫印迹分析(Western blot, WB)：WB法检测干扰后的 MSTN蛋白表达水平，结果详见图4。3个MSTN shRNA实验组较对照组的MSTN蛋白表达量有一定程度的减少，表明pSIR-M664、pSIR-M791和 pSIR-M819均能降低MSTN蛋白的表达。

图4 MSTN的蛋白表达水平检测A.Western blot法：1为shRNA阴性对照组，2～4分别为pSIREN-M664、pSIREN-M791和pSIREN-M819 shRNA表达载体干扰组；B.灰度分析MSTN蛋白质相对表达量;与pSIREN-NC组比较，*P<0.01

讨 论

小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)是能够引起RNA干扰的小片段双链RNA分子。siRNA可以整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，随后双链被分开，其中一条链在RISC作用下特异性与靶mRNA识别结合，通过降解mRNA来阻断靶基因的表达[11]。siRNA阻断基因的表达具有高效性、特异性、操作简单等优点[12]。但siRNA的半衰期短，而shRNA可以克服这一缺点，能够持续性地干涉靶基因[13]。因此，与直接合成siRNA比较，利用shRNA表达载体表达来研究基因沉默要更为有效。对于RNA干扰载体，目前已经开发了许多病毒和非病毒载体，但病毒载体的安全性问题仍然存在。与使用病毒载体的方法比较，使用质粒DNA的基于非病毒载体的方法可能为诱导RNAi的更安全的方法[14]。因此，本研究选用pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒构建shRNA表达载体，以期得到具有显著干扰效果的shRNA分子，为后续通过RNA干扰技术调控MSTN基因表达来改善和治疗MSTN相关疾病奠定基础。

MSTN是可以调控肌肉生长和发育的重要功能基因，其基因序列，尤其是外显子序列，在不同物种间高度同源，十分保守。MSTN主要在骨骼肌中表达，在心肌、脂肪组织、淋巴组织、肺部、脾脏和小肠等其他组织或器官中也有不同程度的表达[15]。随着不断深入的研究，发现MSTN基因除了可以负调控肌肉生长外，在脂代谢、糖代谢、骨形成和骨吸收中也起着重要的调节作用，具有广阔的应用前景和商业价值。MSTN基因的敲减或敲除有助于提高家畜家禽酮体的瘦肉率，从而提高饲料利用率、降低饲养成本，促进家畜家禽的肌肉生长和肉类生产[16]。近年来，对家畜家禽MSTN基因做了大量研究，已有文献报道了牛、山羊、绵羊、猪、鸡、鸭的shRNA真核表达载体和慢病毒载体或腺病毒载体，但其大多是在细胞水平中验证载体干扰效果[17～20]。在医学研究中MSTN基因已被确立为治疗肌肉萎缩、肌营养不良等肌变性疾病的一个新的靶标分子。通过抑制MSTN的表达来改善肌肉萎缩。此外，深入探讨MSTN基因对人类糖尿病、肥胖症、骨质疏松症及其他慢性疾病甚至癌症恶病质的治疗具有重要意义。MSTN基因的siRNA、miRNA、MSTN抗体、MSTN抑制剂等药物方面的研究，在临床医学上体现出很高的应用价值。

综上所述，本研究运用qRT-PCR和WB法分别从mRNA水平和蛋白质水平来验证所设计和构建的pSIREN-MSTN-shRNA表达载体在小鼠体内的干扰效果，为下一步建立动物模型研究MSTN的siRNA质粒治疗效果奠定工作基础。