Ki-67、CK5/6、P53、P63的表达与食管鳞癌发生发展及临床病理特征的相关性

高攀，杨琛擘，余伟，赵鹏程，赵莉莉，王富强，申培红

(1.郑州大学附属肿瘤医院 a.临床病理中心;b.外科，河南 郑州 450008；2.河南大学第一附属医院 肿瘤内科，河南 开封 475000；3.安阳市肿瘤医院 病理中心，河南 安阳 455000)

我国食管癌发病虽有明显的地区差异，但食管癌病死率均较高。近年来食管癌发病率有所下降，但死亡率一直位居第4位[1]。据最新流行病学调查结果显示我国食管癌发病率和死亡率均高于西方国家[2]。食管腺癌在北美和欧洲的发病率呈上升趋势，但食管鳞状细胞癌仍是世界范围内食管癌的主要组织学类型[3]。食管鳞癌是一种恶性肿瘤，发病率高，预后差。因此，寻找能够筛选提示鳞癌的分子标志物对食管鳞癌的防治具有重要意义。细胞角蛋白5/6(cytokeratin5/6，CK5/6)已被证实为三阴性乳腺癌的特征性分子标记物，在基底层细胞中特异性表达。Ki-67是一种在静止期细胞中不表达的非组蛋白，只能在细胞增殖期被检测到，反映细胞的增殖活性。P53是一种抑癌基因，50%以上肿瘤的发生发展都伴有P53的突变或异常表达。P63与P53基因具有高度同源性，主要存在于移行上皮与鳞状上皮的基底细胞中。CK5/6、Ki-67、P53、P63之间的关系如何，目前国内的研究相对较少。本研究通过探讨CK5/6、Ki-67、P53、P63在食管鳞癌患者中的表达及彼此间的相关性，分析其与食管鳞癌患者临床病理特征间的关系，为其在提示食管鳞癌预后和风险分级中的应用奠定基础以及为食管鳞癌新一代靶向药物的研发提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2017年1月至2019年4月安阳市肿瘤医院及郑州大学附属肿瘤医院病理中心确诊的3 200例食管癌患者的病历资料。根据食管癌诊疗标准(2019版)，组织学分型使用2010版消化系统肿瘤WHO分类，经病理活检诊断为食管鳞癌、食管非鳞癌(腺癌、癌肉瘤、印戒细胞癌、神经内分泌癌、上皮内瘤变等)。剔除合并其他肿瘤和缺失病历或病理资料的446例患者，2 754例患者中筛选出均未接受Ki-67、CK5/6、P53、P63病理检测的2 215例患者，最终539例患者纳入研究。根据2018年常见肿瘤AJCC食管癌/食管与胃食管交界处肿瘤分期(第八版)统计食管癌患者病理的浸润深度、区域淋巴结以及是否有远处转移情况，进行TNM分期，将其分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。组织学分级：鳞状细胞癌和腺癌依据分化程度分为高分化(G1)、中分化(G2)、低分化(G3)以及分级情况不确定和无法评估(Gx)。食管鳞癌(271例)：男188例，女83例；年龄43～87岁，平均(64.85±7.53)岁；TNM分期为0期2例，Ⅰ期47例，Ⅱ期98例，Ⅲ期107例，Ⅳ期17例；组织学分级为Gx期18例，G1期27例，G2期109例，G3期117例；淋巴结转移情况为N0(无淋巴结转移)139例，N1(1～2个淋巴结转移)63例，N2(3～6个淋巴结转移)54例，N3(≥7个淋巴结转移)15例。食管非鳞癌(268例)：男205例，女63例；年龄29～91岁，平均(66.03±7.84)岁；TNM分期为0期0例，Ⅰ期24例，Ⅱ期86例，Ⅲ期122例，Ⅳ期36例；组织学分级为Gx期69例，G1期5例，G2期82例，G3期112例；淋巴结转移情况为N0104例，N160例，N268例，N336例。

1.2 纳入及排除标准纳入标准：(1)被安阳市肿瘤医院及郑州大学附属肿瘤医院病理中心确诊为食管癌(鳞癌和非鳞癌)；(2)取患者部分食管、部分胃及区域淋巴结进行活检；(3)不伴有其他重要器官严重病变，如心、肺功能不全；(4)患者有完整的病理及临床资料。排除标准：(1)未经病理中心检查的病例；(2)病理、临床资料不完善及缺少本研究所需指标的患者。

1.3 检测方法免疫组化染色：将所有标本制成常规组织石蜡切片后，采用streptavidin- peroxidase(SP)免疫组织化学法进行染色。抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司。结果判定如下。CK5/6阳性细胞为在细胞质中出现棕黄色或黄色颗粒的肿瘤细胞；标本中随机选取10个高倍镜视野(×400)，平均阳性细胞率≥5%记为(+)，<5%记为(-)。Ki-67阳性细胞为细胞核呈棕黄色或黄色颗粒的细胞，取任意10个高倍视野(×400)，平均阳性细胞数≤10%为阴性(-)，>10%为阳性(+)。P53、P63以细胞核出现黄褐色颗粒为阳性细胞，P53、P63以阳性细胞数≤10%为阴性(-)，阳性细胞数>10%为阳性(+)。由病理中心两名高级别职称的医生采用独立双盲观察免疫组织化学染色切片，判断细胞的染色强度。

2 结果

2.1 食管鳞癌和食管非鳞癌患者临床指标539例肿瘤标本中，实际获得455例Ki-67检测结果，其中Ki-67阳性表达427例，占93.8%，阴性表达28例，占6.2%。143例CK5/6检测结果，其中阳性表达112例，占78.3%，阴性表达31例，占21.7%。359例P53检测结果，其中阳性表达261例，占72.7%，阴性表达98例，占27.3%。308例P63检测结果，其中阳性表达259例，占84.1%，阴性表达49例，占15.9%。食管鳞癌和食管非鳞癌患者神经侵犯、脉管癌栓、淋巴结转移、TNM分期、组织学分级、CK5/6、Ki-67、P63比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 食管鳞癌和食管非鳞癌患者临床指标比较[n(%)]

2.2 Ki-67、CK5/6、P53、P63表达与食管鳞癌患者临床指标的关系食管鳞癌中231例Ki-67检测结果中阳性表达207例，占89.6%，阴性表达24例，占10.4%。98例CK5/6检测中阳性表达93例，占94.9%，阴性表达5例，占5.1%。144例P53检测中阳性表达98例，占68.1%，阴性表达46例，占31.9%。244例P63检测中阳性表达235例，占96.3%，阴性表达9例，占3.7%。在食管鳞癌中，P53与TNM分期有关(P<0.05)，与年龄、性别、脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移、组织学分级均无关(均P>0.05)；Ki-67、CK5/6、P63与年龄、性别、脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移、TNM分期、组织学分级均无关(均P>0.05)。见表2。

2.3 食管鳞癌中CK5/6、Ki-67、P53、P63的相关性Spearman相关性分析显示，在食管鳞癌中，CK5/6与Ki-67、P53与P63、CK5/6与P53、CK5/6与P63、Ki67与P53、Ki-67与P63在食管鳞癌中的表达均呈正相关(r1=0.920、r2=0.741、r3=0.645、r4=0.967、r5=0.724、r6=0.939，均P<0.05)。

3 讨论

食管癌属于消化道系统的恶性肿瘤，根据组织学类型分为鳞癌、腺癌、小细胞未分化癌和癌肉瘤等，其中鳞癌最为常见[3]。食管鳞癌分子标记物较多，缺乏特异性，各肿瘤分子标记物之间的相关性研究较少。本研究以CK5/6、Ki-67、P53、P63 4种肿瘤分子标记物为中心，探讨4种肿瘤标记物与食管鳞癌各临床指标以及自身之间的相关性。研究发现，CK5/6、P63是鳞癌中常用的标记物，在原发性肺鳞癌中CK5/6的敏感性略高于P63，特异性与P63相似，在转移性肺鳞癌中CK5/6和P63的敏感性相同，但CK5/6的特异性高于P63[4]。Shibata等[5]研究发现，P53、Ki-67与食管鳞癌淋巴结的转移相关。不同的病理类型，治疗方案不同。本研究中纳入CK5/6、Ki-67、P53、P63 4个研究指标，结果显示，与食管非鳞癌相比，食管鳞癌中CK5/6、Ki-67、P63表达水平较高，表明食管鳞癌预后差，死亡率高及这3项指标联合检测可用于区分食管鳞癌与非食管鳞癌，用于指导临床用药。P53与TNM分期相关，说明Ⅲ～Ⅳ期P53阳性率高于0～Ⅱ期，即P53可用于预后评判，其与食管癌的发生发展存在一定联系，还需大量临床研究进一步证实。

食管鳞癌是食管癌组织学分型的一种，属于预后不良的恶性肿瘤之一，5年生存率不足30%[6]。CK5/6主要表达在皮肤的基底细胞、棘层细胞和部分前列腺基底细胞，于其他单层腺上皮不表达，常用于三阴性乳腺癌的研究，较少用于食管鳞癌的研究。有研究表明，CK5/6的表达可以作为乳腺癌的预后标志物[7]，CK5/6阳性为乳腺癌预后差的标志[8]。目前研究对于CK5/6与年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期的相关性仍存在争议[9]。本研究中CK5/6与患者年龄、性别、脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移、TNM分期、组织学分级均无关，在食管鳞癌中也证实了这一点，还需进一步增加样本量来提高可靠性。

表2 Ki-67、CK5/6、P53、P63表达与食管鳞癌患者临床指标的关系

注：回顾性研究存在部分检测数据缺失。

Ki-67是一种能有效反映细胞增殖的标志物，位于细胞核内，在细胞增殖的过程中表达，有丝分裂期达到峰值，静止期的细胞不表达。据研究报道，Ki-67可以作为评价化疗敏感性的标志物[10-12]。研究发现，Ki-67与临床病理特征及患者预后具有显著的相关性[13-15]。在本研究中食管鳞癌患者虽然高表达Ki-67，但Ki-67与临床病理特征无相关性。目前Ki-67的临界值无法统一，为1%～35%，仅St.Gallen共识就进行了4次调整[16-19]，这可能是导致研究结果不一致的原因之一。本研究数据较少，且食管癌存在明显地区差异，故仍需要大量研究进一步证实。

P53基因是一种抑癌基因，它与多种恶性肿瘤的发生、发展有明显的相关性。研究表明，在所有恶性肿瘤中，该基因的突变率约为50%[20]。Huang等[21]研究发现，P53基因突变后，肿瘤的侵袭力增强，这可能表明P53与分期存在相关性。由于P53改变是食管鳞癌治疗反应和生存的良好预测因子，P53正常的患者5年生存率高于P53突变患者[22]。本研究中P53的表达与临床TNM分期有关，即Ⅲ～Ⅳ期的食管癌患者P53的阳性表达高于0～Ⅱ期的患者，进一步表明P53与肿瘤预后相关。目前，以P53为靶点的研究已成为治疗癌症的焦点。有研究表明，化学物质与P53靶标组合为治疗药物可以增强对P53突变肿瘤的功效，并减少对正常细胞和组织的毒副作用[23]。本研究中，P53在食管鳞癌与食管非鳞癌患者中表达无显著差异，表明P53无论在食管鳞癌还是食管非鳞癌中均呈高表达，不可用于食管癌的鉴别诊断，但为靶向药物的研发提供依据。

P63表达于上皮组织基底层，在正常上皮组织的形成中发挥重要作用，P63在鳞状细胞源性的各种良恶性肿瘤组织中均表达，尤其在鳞状细胞癌组织中表达增强，且表达频率及分布与鳞癌细胞间变程度显著相关[24]。本研究中P63在食管鳞癌与食管非鳞癌患者中表达存在显著差异，可与CK5/6、Ki-67联合检测用于食管鳞癌的诊断。

周晨阳等[9]研究发现，在三阴性乳腺癌肿瘤组织中CK5/6、Ki-67呈正相关，CK5/6与P53、P63无相关性，Ki-67与P53、P63无相关性，与本研究结果不相符。这可能与本研究为回顾性分析，所选资料存在选择性偏倚或不同肿瘤中其肿瘤分子标志物表达不同有关。本研究发现，CK5/6、Ki-67、P53、P63在食管鳞癌中的表达均呈正相关，反映了CK5/6、Ki-67、P53、P63在食管鳞癌中表达的一致性，利于食管鳞癌预后的评估及风险分级，或许联合应用能够增强检测食管鳞癌的敏感性及特异性。

由于食管非鳞癌较为少见，尚未在食管非鳞癌中对CK5/6、Ki-67、P53、P63进行相关分析，这也是需要进一步探讨的问题，希望能对食管鳞癌的鉴别诊断和危险分级提供参考，对研究食管靶向药物提供依据。