腐植酸类物质在氮循环中作用的研究进展

高同国 袁红莉 侯慧云 姚艳辉 高 峰

1 河北农业大学生命科学学院 保定 071000

2 中国农业大学生物学院 北京 100193

氮元素是控制初级生产力的关键元素之一，氮循环是构成地球生态系统元素循环的核心组成部分，主要包括生物体内有机氮的合成、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用（图1）[1]。微生物在各种形态氮的转化过程中发挥着重要作用，是驱动氮循环的强大引擎[2，3]。虽然氮肥的使用在很大程度上提高了作物产量，但我国氮肥利用率不足30%，施入土壤的氮肥大部分通过氨挥发、硝化-反硝化、淋洗、径流等途径损失，造成氮肥资源严重浪费[4]，且导致自然界原有的氮循环严重失衡，引起水体富营养化、土壤酸化、温室气体排放等一系列环境问题，氮平衡问题受到全球广泛关注。

图1 氮循环示意图[1]Fig.1 Schematic of the nitrogen cycle

腐植酸是由芳香族及其活性官能团构成的天然高分子酸性有机混合物，外观呈黑色或褐色，在土壤、湿地和煤炭中均有分布。自然界中的腐植酸是由动植物残骸经微生物的分解和转化及长期的地球化学作用形成和积累的。腐植酸在农业生产中具有改良土壤性质、刺激作物生长、增加养分吸收利用、提高作物抗逆和改善农产品品质等功效。此外，腐植酸是土壤的重要组成部分，与土壤酶活性和土壤微生物活动密切相关。并且腐植酸在地球氮循环中发挥重要作用，不仅可以络合吸附无机氮化合物，参与含氮化合物转化，还可以影响与氮循环相关酶的活性以减缓氮肥释放速度，提高氮肥利用率，减少化肥施用量，调节氮循环相关微生物的活动，影响氮循环相关微生物数量等。本文总结了腐植酸在氮循环各个环节中的作用，以期为更广泛和深入地研究腐植酸物质提供理论基础，为腐植酸调控和管理氮平衡提供参考。

1 腐植酸含有氮元素

腐植酸的分子量、化学成分、结构、官能团，及其聚电解质性质因地域、形成年代、提取方法不同而差异较大[5～7]。根据腐植酸对酸、碱溶解度的差异，腐植酸分为黄腐酸、棕腐酸、黑腐酸。元素分析结果表明，自然界中提取得到的腐植酸主要由碳、氢、氧、氮、磷、硫等元素组成，其中氮的含量因原料来源、提取方法等差别很大，一般在0.5%～7.3%之间[8～10]。并且热处理会增加提取的腐植酸中氮元素的含量[11]。腐植酸含有氮元素，是氮循环的组成部分之一，腐植酸中的氮可以矿化为无机氮，供给植物吸收利用。

2 腐植酸络合吸附无机氮

腐植酸是一种结构复杂的大分子聚合物，分子量从几百到三十万道尔顿之间。腐植酸以芳香族核为结构主体，附以各种官能团，有羧基、羰基、醌基、酚羟基、醇羟基、氨基、酰胺基、甲氧基等[12]，使其具有很好的络合和螯合能力，可通过络合、螯合、吸附等作用与其他物质形成稳定的复合物。腐植酸还可以与土壤中氨以共价键形式结合。Nommik等[13]研究土壤有机质的固氨现象，推测氨通过共价键与腐殖物质上的某些官能团结合，生成一种抵抗微生物硝化、反硝化转化过程，又防止进一步化学变化的酸不能水解的物质，这部分氨不会被矿化，可以被植物利用。Burge等[14]的研究结果表明，腐植酸结合氨的现象与腐植酸中羟基有关，与醛基无关。

腐植酸具有较高的阳离子交换能力和较强的吸附能力，在调控土壤氮素有效性，保蓄NH4+以及降低氨挥发量等方面起着重要作用[15]。腐植酸的羧基及酚羟基等能与尿素反应，形成腐植酸-脲络合物，在此反应中，羧基起更重要的作用。尿素在反应中分解出部分氨态氮能被羧基固定，减少氮素损失。腐植酸添加量会影响到腐植酸尿素中的官能团数量及水溶性腐植酸含量，进而影响尿素的缓释效果[16，17]。尿素施入土壤后水解为铵态氮再经硝化作用转变为硝态氮，腐植酸增加了对土壤铵态氮和硝态氮的吸附，从而减少了土壤氮素的淋溶，增加了土壤氮素残留量，有效地降低氮肥向深层土壤的迁移，从而更好地满足作物根系需肥特性[18]。研究表明，腐植酸与氨的吸附与环境中pH关系密切，在pH为4～8时，随着pH的升高，腐植酸对NH4+的吸附和解吸过程更易进行，特别是在弱碱条件下，腐植酸对NH4+的吸附和解吸附效果更好[19]。

3 腐植酸参与无机氮转化

空气中存在少量的二氧化氮气体，Stemmler等[20]首次发现在有腐植酸存在时，空气中含有的二氧化氮在光照条件下可以转化成亚硝酸，这一过程在黑暗条件下不能发生。推测认为腐植酸在光照条件下生成了一种还原剂，促使二氧化氮转变成亚硝酸。并且这一过程在随后报道中得到证实[21，22]，研究发现这一过程与光的照射强度，含有的腐植酸浓度、环境相对湿度、厌氧环境等有关[23]。这一发现说明腐植酸能够在一定条件下改变氮素的存在形式。

早在1992年，腐植酸参与氮化合物转化的过程被证实。Thorn等[24]用同位素15N标记氢氧化铵，采用15N、13C NMR技术研究了铵的转化形态，表明大部分的氮进入腐植酸中转化成了吲哚和吡咯形式的氮，接着转变成嘧啶、吡嗪、氨基化合物和氨基醌。Dong等[25]的研究也证实了腐植酸参与氮化物的转化过程，表明腐植酸可结合尿素或硫酸铵，在化学反应中生成中间及终产物态氮，并以Nδ/Nε-精氨酸、Nω/Nα-瓜氨酸、氨基酸或氨基糖中游离或离子化的氨基以及NH4+形式存在于腐植酸中。氮肥（NO3-）大量使用过程中，NO3-经过微生物反硝化或化学作用，生成NO2-和温室气体N2O等，从而造成了水质和气候的改变，破坏生态平衡。腐植酸可以与生成的NO2-反应，从而抑制反硝化过程，提高氮肥利用率，减少环境污染[26]。腐植酸的这一过程与其含有的羧基相关，并且通过pH改变腐植酸中羧基和酚基的含量来影响质子的转移和气态亚硝酸（HONO）与NO2-的平衡，即pH越小HONO产率越高[27]。这种化学抑制反硝化的条件发生在中性或微酸性的土壤环境中，Thorn等[24]用Na15NO2、15NH2OH和15NH3分别标记泥炭腐植酸，培养后经固相CP/MAS15N NMR检测，得到了化学位移在169 nm和31 nm处的新峰，对应氮的形态分别是杂环氮，游离氨基酸和氨基糖，说明亚硝酸可以与腐植酸发生化学反应，减少亚硝酸的积累量。庄振东等[18]利用同位素示踪技术的结果也证实施用腐植酸氮肥明显地抑制了土壤中氮素的硝化作用从而也抑制了土壤的反硝化作用。

4 腐植酸促进有机氮矿化

有机氮矿化是指有机态氮经微生物分解形成无机态氮的过程。植物吸收的一部分氮来自于土壤有机物矿化氮。腐植酸在氮矿化中具有重要的促进作用，但同时土壤的腐殖化程度直接影响氮矿化速率[28]。氮矿化一般通过测定土壤中总氮及总碳的含量来预测矿化氮的比率，庄振东等[29]发现施用腐植酸氮肥可增加土壤氮肥盈余量和土壤氮素矿化量，腐植酸氮肥能较好地调节土壤C/N比，提高土壤氮肥矿化作用。芳香化程度低的腐植酸更有利于有机氮的矿化，Ve等[30]将芳香化程度低的矿物源腐植酸和芳香化程度高的腐植酸钙加入到不同水稻土壤中厌氧培养6周，结果发现：随着腐植酸芳香化程度的增加，矿化氮的量成指数递减，说明水稻土壤矿化氮的比率受土壤有机物芳香化程度影响，即有机质芳香化程度越高，矿化氮的比率越低，反之亦然。随后Olk等[31]也证实青年腐植酸中存在的大量木质素酚化合物结构不利于氮矿化的进行。但腐植酸的腐殖化程度如何影响到氮矿化的，这一机理尚不清楚。

5 腐植酸促进植物对氮的吸收与分布

Pamela等[32]在其相关综述中指出，众多研究都表明，腐植酸能促进植物对氮素的吸收。腐植酸影响氮的同化，并影响到硝酸还原酶活性等植物氮代谢相关酶的活性[33]，促进氮的吸收和代谢，增加可溶性蛋白质含量，促进氨基酸合成，对硝酸盐代谢产生积极影响。此外，植物中与氮同化、三羧酸循环相关酶活性和转录也受到显著刺激[34]。Ertani等[35]也证实了腐植酸可以改变植物中硝酸盐代谢和蛋白质合成相关酶的活性。腐植酸可以使玉米根和叶中硝酸盐含量下降，蛋白质含量增加，而总氮含量则保持稳定；腐植酸可以使谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性有较高的增加，硝酸还原酶活性基本不受影响。另外，腐植酸还可以增加有机氮合成和光合作用相关酶活性[36]，以满足植物对氮的需求。总之，腐植酸可以影响植物氮代谢相关酶的活性。

但作物对土壤中氮素的吸收能力还受腐植酸添加量及土壤氮素水平的影响。土壤中添加一定量的腐植酸可以提高氮肥的有效性，但并不是越多越好，过多反而会产生不利影响[37]。Tahir等[38]的研究表明，土壤中腐植酸施用量为60 mg/kg土的中等用量，对小麦生长和氮素吸收具有较好的促进作用，而在较高的添加量90 mg/kg土时反而不利于小麦的生长及氮素的吸收，这可能由于腐植酸中含的羧基、酚羟基、羰基、醌基等多种官能基团与尿素、铵离子等发生络合反应，官能团的多少直接影响到尿素的使用效果[12]。其次，腐植酸是否能够促进氮素的吸收也取决于环境中氮素水平。腐植酸对黄瓜幼苗NO3-的吸收，表现为低氮胁迫下促进吸收、高氮胁迫下抑制吸收的趋势。腐植酸显著降低了低氮、高氮胁迫下根系和叶片中的铵态氮含量，不同程度地提高了氮胁迫下根系和叶片的硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、谷氨酸脱氢酶活性及根系中亚硝酸还原酶活性，还提高了根系和叶片中游离氨基酸、可溶性蛋白的含量[38]。

6 腐植酸稳定脲酶活性

农业生产中使用最多的氮肥形式为尿素，其需要经脲酶转化成植物能够直接利用的氮素形式——氨，即脲酶可以将尿素分解成氨和二氧化碳，因此脲酶在氮素循环中具有重要作用。腐植酸不仅可以抑制脲酶的活性，也可以提高脲酶的稳定性[16]。游离脲酶随着时间的延长稳定性逐渐下降，而脲酶-腐植酸复合物对脲酶有一定稳定作用，特别是在碱性条件下，腐植酸能够有效地提高溶液中脲酶的稳定性，并且随着腐植酸与脲酶比例的增加，复合物中脲酶的活性逐渐增加[39]。腐植酸可以增加脲酶热稳定性中的抗热性，防止蛋白酶对其分解[40]。腐植酸和脲酶的相互作用主要取决于复合物的相互作用基团和静电吸引力，但是在等电点处氢离子的作用和补偿离子的释放在两者结合中也起着重要作用[39]。高分子量的腐植酸能稳定脲酶的活性，而低分子量的腐植酸反而抑制酶的活性，说明不同分子量和结构的腐植酸对酶的作用不同[41]。Dong等[42]的研究结果表明，在使用尿素时添加腐植酸可以在短时间内对脲酶起抑制作用，大分子量的腐植酸在较长时间内能够稳定脲酶的活性，从而在一定时间内稳定尿素转变成氨的速率，持久有效地供给植物可直接吸收利用的氨。相反，若尿素短时间内大量转化成氨，不但不能够全部被植物吸收而造成氮肥利用率降低，而且一部分氨将转化成硝酸盐进而通过反硝化作用最终对环境造成污染。即腐植酸可以稳定脲酶的活性，提高尿素的利用率。

7 腐植酸提高生物固氮能力

生物固氮是土壤中氮素的重要来源之一，是生物圈氮循环中重要的途径。生物固氮分为自生固氮、联合固氮和共生固氮，其中以共生固氮能力效率最高。Allison等[43]首先发现腐植酸可以增加蓝绿藻的生长及固氮作用，Bhardwaj等[44]发现腐植酸能够促进联合固氮菌Azotobacter chroococcum的生长及固氮能力，并推测认为这种固氮能力的提高与腐植酸中含有的活性离子或与腐植酸促进的细胞数量增加有关。随后多篇文献报道了腐植酸可以促进豆科植物结瘤固氮过程。腐植酸可以增加大豆、花生等豆科植物的根瘤干重[45]，提高田菁等豆科植物[46，47]的结瘤数量、根瘤重量以及固氮酶活性，并且提高豇豆根瘤中氮含量[48]。袁红莉等[49]也证实了微生物降解褐煤生成的水溶性腐植酸可以增加豆科植物的结瘤量，增加根瘤重量；同时可提高单位质量苜蓿中根瘤固氮酶活性，进一步增加苜蓿的固氮总量，2年使苜蓿增产高达25.02%[50]。此外，上述水溶性腐植酸还能够提高大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium liaoningense CCBAU05525的细胞密度；腐植酸中含有的黄酮类似物的结构可促进根瘤菌结瘤基因及固氮相关基因的表达，从而使大豆的结瘤数、根瘤鲜重、固氮酶活性分别提高19.4%～30.5%、25.4%～36%、15%～30%[51]。腐植酸可以增强生物固氮能力，但其机理尚不清楚。

8 腐植酸改变氮循环相关微生物数量

腐植酸会影响土壤中与氮循环相关微生物的活性。如陈静等[52]发现腐植酸能够加剧土壤微生物活动，尤其能使土壤自生固氮菌的数量显著增加，生物固氮作用得到加强，为作物提供丰富的氮素营养。并且实时荧光定量核酸扩增检测系统（QPCR）结果表明，腐植酸可以增加参与氮循环微生物的丰度[53]，即腐植酸可以通过调节根际参与氮循环微生物的丰度、基因表达及代谢活动，从而实现植物对氮素营养的利用。此外，腐植酸可以通过抑制土壤脲酶活性来影响氨的释放速度，从而影响氨氧化微生物的群落结构，抑制因尿素加入导致的氨氧化细菌和氨氧化古菌数量增加，降低氨氧化菌与植物竞争氨，减少氨的损失，提高尿素利用率；同时阻止部分氨转化为硝酸，降低了对环境的污染[16，54]。Kraiem等[55]采用荧光原位杂交技术（FISH）发现，受腐植酸浓度影响，厌氧反应器中厌氧氨氧化细菌及其共生菌的丰度显著降低，异养反硝化细菌明显生长。另外，虽然高通量测序技术已成功用于土壤微生物群落结构的分析，也有较多的研究表明，腐植酸可以提高细菌的数量和丰度，但未发现该技术用于腐植酸对氮循环相关微生物研究的报道。

9 总结和展望

土壤是地球上最大的碳库，腐植酸是土壤中的重要组成部分，腐植酸在土壤中的稳碳固碳功能及在地球碳循环中的作用得到人们的认可。但腐植酸在氮循环中的作用目前多集中于氮肥的利用上。腐植酸与氮循环之间的关系主要体现在络合无机氮起到缓释效果、参与无机氮化物的转化途径、抑制硝化与反硝化作用提高氮肥利用率、提高氮肥的矿化作用、促进植物吸收氮素、提高豆科植物结瘤固氮能力、提高土壤脲酶等土壤酶活性、影响氮循环相关微生物的数量等。本文首次总结了腐植酸在氮循环中的作用，以期为合理开发利用腐植酸相关产品，研究腐植酸相关产品在氮循环中的作用机理，管理土壤中的氮素平衡提供理论基础。

腐植酸在氮循环中的部分作用已经证实，但大多集中于腐植酸如何提高氮肥利用率上。随着腐植酸研究的深入以及应用范围的逐渐扩大，腐植酸与氮循环之间的关系将逐渐清晰，目前还需要完成以下几方面的工作。

（1）腐植酸结构与活性之间的关系。

国内外对腐植酸进行了多年的研究，但腐植酸产品因其地域、来源、提取方法差异等因素，结构复杂多样，化学组成及官能团结构差异明显，势必造成其功能与使用上的差异。关于腐植酸结构的研究方法很多，多集中于采用核磁共振、红外光谱、元素分析等方法对腐植酸的元素组成、分子量、芳香化程度、氧化程度等信息进行表征，揭示其与活性之间的关系。即使采用现代检测手段与先进的设备，腐植酸与活性之间的关系目前仍不太清楚，依然是今后研究的重点与难点。

（2）腐植酸与氮循环相关微生物的关系。

自然界中氮循环均由微生物驱动，微生物在各种形态氮的转化过程中发挥着重要作用。目前关于腐植酸与氮循环相关微生物的研究很少，多集中于硝化细菌和反硝化细菌研究上，固氮微生物的研究也有，但还比较少，机理也尚不清楚。今后研究腐植酸驱动氮循环相关微生物的活动对揭示腐植酸在地球氮循环中的作用和地位十分重要，又可为利用腐植酸管理土壤氮素水平提供理论依据。

（3）腐植酸提高豆科植物结瘤固氮能力的作用机理。

生物固氮在全球氮循环和农业生产中占有十分重要的地位，根瘤菌-豆科植物共生固氮体系是生物固氮中最强的固氮体系，每年固氮量占生物固氮总量的65%。根瘤菌与豆科植物形成的共生结构——根瘤是氮固定场所。利用根瘤菌剂接种豆科植物提高固氮效率在国外应用广泛，如美国、巴西等国。增加豆科植物种植面积和接种根瘤菌可以减少化肥施用量。氮肥的过量施用导致土壤氮残留量较高，进而抑制根瘤菌对豆科植物的侵染，减少豆科植物根瘤数量。腐植酸可以提高豆科植物结瘤数量及固氮酶活性，但其机理尚不清楚。研究腐植酸促进生物固氮的机理在减少化肥施用、保护生态环境、提高农作物产量、维持农业可持续发展等方面具有重要作用。