氨基酸分子印迹传感器的制备及其在手性识别中的应用

何静娴，张文元，赵国虎，刘芳，缑浩

(兰州城市学院化学化工学院，甘肃 兰州 730070)

氨基酸是构成生命体最基本的单元，在生命活动中发挥着重要作用[1]，可以用来治疗疾病，作为药物前驱体来生产药品.目前世界上利用氨基酸前驱体来制造的药品多达一百多种[2-3]，例如复方结晶氨基酸营养液[4]、代血浆所用的注射液[5]、氨基酸口服液[6]以及青霉素G和溶菌酶中加入氨基酸衍生物[7]，特别是添加氨基酸酯，青霉素G和溶菌酶表现出较强的抗菌和杀菌能力[8].氨基酸在药品生产中扮演的角色不容小觑[9].

氨基酸具有手性，有L和D型之分[10].人体中所含有的氨基酸基本都是L型氨基酸，摄入的D型氨基酸也只有转化为L型氨基酸才能被吸收[11]，如果摄入过多的D型氨基酸，会引起中毒，甚至危及人体生命[12].随着科技的发展，越来越多的手性药物(包括氨基酸类药品)被制造并用于临床来治疗疾病.但同一种手性药物的不同构型作用于人体时药效可能截然不同[13-14].在欧洲，医生曾给孕妇服用没有经过拆分消旋体的药物作为镇痛药或止吐药，结果出生了许多无手或缺腿的先天畸形儿，称为“海豹婴儿”.仅仅4年时间，世界范围内诞生了1.2万多畸形的“海豹婴儿”，这就是“反应停”惨剧[15].后来经过研究发现，反应停的R体有镇静作用，但是S-对映体对胚胎有很强的致畸作用[16].因此现在生产出来的氨基酸必须进行构型和纯度的检测，当直接作为药品或者作为药品原料的生产及销售之前也必须进行构型和纯度的检测，对氨基酸进行手性识别是十分必要的[17]，单一构型的氨基酸在生产中发挥着重要的作用.

分子印迹是通过印迹分子与聚合物单体相接触时会形成多重作用点，通过聚合过程来记忆这种相互作用，当印迹分子被洗脱时，聚合物中就形成了与印迹分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对印迹分子及其类似物具有选择识别特性[18].分子印迹传感器具有灵敏度高、选择性好、价格低廉等许多优点，受到许多研究者广泛的关注和深入的研究，手性传感器可用于检测链霉素，赤霉素，青蒿素等药物[19-21]，异丙隆，强力霉素等农药残留[22].

分子印迹传感器在特异性识别方面具有独特的优势，但在手性识别药物方面却应用较少，与传统的手性识别方法如光谱法、色谱法等方法相比灵敏度更高，选择性更好，且操作简单价格低廉，更具实际应用的价值.本文以石墨烯为基底材料，聚赖氨酸为功能分子，色氨酸为印迹分子，将聚赖氨酸和L-色氨酸通过电沉积的方式沉积在石墨烯电极上，并用洗脱液洗去印迹分子L-色氨酸，制备成分子印迹传感器识别D型和L-型色氨酸，并研究不同pH，不同沉积时间对传感器的性能影响.得到最佳试验条件后，所制备的分子印迹传感器可以应用于实际检测色氨酸对映体及某一构型氨基酸的纯度.

1 材料与方法

1.1 试验材料

高锰酸钾(分析纯)，天津市南大化学试剂厂；石墨粉(分析纯)，aladdin试剂；硫酸，浓盐酸，磷酸，无水甲醇(分析纯)，北京化工厂；过氧化氢(分析纯)，上海沃凯生物技术有限公司；氨水，水合肼(分析纯)，上海中秦化学试剂有限公司；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠(分析纯)，烟台市双双化工有限公司；L-色氨酸(分析纯)，aladdin试剂；聚赖氨酸(分析纯)，源叶生物；D-型色氨酸(分析纯)，上海化学试剂有限公司；乙酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，分析纯)，利安隆博华医药化学有限公司；亚铁氰化钾，铁氰化钾(分析纯)，天津市凯信化学工业有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 还原氧化石墨烯的合成 利用Hummers法合成氧化石墨[23].称取0.3 g氧化石墨并加入300 mL蒸馏水超声分散2 h.加入0.3 g水合肼，用氨水调节pH值到10，95 ℃回流反应2 h，真空抽滤，并用蒸馏水洗涤3次，放入真空干燥箱干燥.

1.2.2 还原氧化石墨烯/聚赖氨酸分子印迹(电极)传感器的制备 称取6 mg还原氧化石墨烯，加入6 mL DMF溶液，超声分散半小时.量取5 μL上述分散液滴涂在玻碳电极表面，红外灯下烘干得到还原氧化石墨烯修饰电极.将修饰电极浸入聚赖氨酸和L-色氨酸印迹溶液中进行电沉积，电位范围为0～0.6 V、扫描速度为50 mV/s、扫描圈数为10.电沉积后将电极在室温下干燥，之后在甲醇和乙酸体积比为9∶1的L-色氨酸洗脱液中浸泡5 min后，用蒸馏水再次洗涤干燥，得到分子印迹电极.

1.2.3 电解溶液的配制 称取铁氰化钾0.205 g，亚铁氰化钾0.263 g，氯化钾1.9 g于250 mL容量中定容.分别称取0.051 1 g L-色氨酸和D-色氨酸于50 mL容量瓶，用铁氰化钾溶液摇匀定容.

1.2.4 测试与表征 EQUINOX55型红外光谱仪进行红外光谱分析时，样品用KBr压片，扫描范围400～4 000 cm-1.扫描电子显微镜观察样品形貌时，先对样品使用辉光放射喷金处理.CHI660E型电化学工作站测试样品时，所有的电化学表征均在三电极体系中测试，玻碳电极和修饰的玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极.循环伏安(CV)在5 mM[Fe(CN)6]4-/3-并含有0.1 M KNO3的电解液中测试，扫描范围为-0.2～0.6 V，扫速为50 mV/s，取样间隔为0.001 V.差分脉冲伏安法(DPV)在由特定比例的PBS和色氨酸对映体组成的电解液中测试，扫描范围为-0.2～0.6 V，振幅为0.05 V，脉冲宽度为0.05 s，脉冲周期为0.5 s.

2 结果与分析

2.1 分子印迹传感器的结构表征

图1A和图1B分别为氧化石墨和还原氧化石墨烯的扫描电镜图.氧化石墨呈片状结构，柔韧性较好有褶皱结构，但部分位置仍有片层堆积，且表面附着有颗粒物质，可能是氧化剂残余所导致.还原后的氧化石墨烯，如同细纱一样，有自然的褶皱，表面比较光滑，并且具有大的尺寸和较少的片层.这种独特的二维平面结构使它成为分子印迹传感器优秀的基底材料，使传感器具有优异的电化学性能，可提高检测的灵敏度.

图1 氧化石墨(A)和还原氧化石墨烯(B)的扫描电镜图

图2所示为氧化石墨、还原氧化石墨烯和聚赖氨酸的红外图谱.聚赖氨酸在3 345 cm-1处有很强的吸收峰，这是属于-NH2的吸收峰，3 064 cm-1处则为苯环的C-H伸缩振动峰，1 695 cm-1处为苯环上的C-H面外弯曲振动吸收峰，1 041 cm-1处则是R-O的伸缩振动峰.氧化石墨在3 435 cm-1处有1个很宽、很强的吸收峰，是-OH的伸缩振动峰；1 662 cm-1处的峰是羧基上的C=O的伸缩振动峰，1 468 cm-1出现的吸收峰，则可能是由于C-OH的弯曲振动；1 098 cm-1处出现的峰，则归于C-O-C的伸缩振动.而还原氧化石墨烯在3 435 cm-1和1 712 cm-1处的吸收峰大幅度减弱，说明氧化石墨被水合肼成功还原，位于1 598 cm-1处的C-OH和1 018 cm-1处的C-O-C的峰也有所降低证明成功制备了还原氧化石墨烯.

图2 氧化石墨、还原氧化石墨烯和聚赖氨酸的红外表征

2.2 分子印迹传感器的电化学性能表征

由图3(a)可知，裸电极具有对称性很好且可逆的氧化还原峰，说明[Fe(CN)6]3-/4-在玻碳电极的表面有很好的电子转移过程.同样的，还原氧化石墨烯电极也出现可逆且对称的氧化还原峰，而且从图3(b)中知，经过修饰的电极峰电流比玻碳电极明显升高，峰的面积增大，这是由于还原氧化石墨烯具有优良的导电性、较大的比表面积、快速的电子转移速率，从而促进了电子的转移，加速了[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原反应的速率.当电极表面修饰聚赖氨酸色氨酸后，从图3(c)可知，由于聚赖氨酸色氨酸不导电，峰电流相比还原氧化石墨烯电极有了降低，峰面积也变小，这是因为复合材料的掺杂使得还原氧化石墨烯的导电性和电子转移速率下降.相应的，由图3(d)可知，单纯修饰聚赖氨酸的电极的峰电流值和峰面积与还原氧化石墨烯电极相比也有所下降.但相比于同时修饰聚赖氨酸色氨酸电极，由于其导电性更高，峰电流值和峰面积也相应变大.通过CV曲线中峰电流值与峰面积的变化，证明聚赖氨酸和色氨酸已经成功的修饰在还原氧化石墨烯的基底上.

a：裸电极；b：还原氧化石墨烯；c：还原氧化石墨烯/聚赖氨酸/色氨酸；d：还原氧化石墨烯/聚赖氨酸.

图4所示为还原氧化石墨烯/聚赖氨酸电极在10～90 mV/s不同扫速下的循环伏安图.随着扫描电流的增加，峰电流也随着增加.另外，不同扫速下的峰电流值与扫速的平方根有较好的线性关系(R2=0.994 18)，说明这个电化学过程为扩散控制，电极反应受表面控制，证明了此电极在10～90 mV/s范围内均可进行电化学识别.

从a到e分别是还原氧化石墨烯/聚赖氨酸电极在扫描速度10、30、50、70、90 mV/s下的循环伏安图；内图：电流响应与扫速的关系.

2.3 分子印迹传感器的应用

2.3.1 对氨基酸对映体的识别 图5所示为采用了差分脉冲伏安法对比研究了5.0 mmol/L色氨酸对映体在不同电极上的电化学行为.色氨酸在0～0.3 V电位范围内出现了1个氧化峰，L-色氨酸和D-色氨酸的峰电流几乎相等，表明色氨酸对映体与玻碳电极不会发生相互作用，色氨酸对映体在玻碳电极上不能被有效区分，无法进行手性识别.图5(B)为D型色氨酸的峰电流值和L型色氨酸的峰电流值的比值(ID/IL)变为1.03，这是因为还原氧化石墨烯上的官能团与色氨酸分子上的基团之间可以形成微弱的作用力，但这种峰电流的差异太小，不能用于手性识别.图5(C)中ID/IL由1.03上升为4.36，表明还原氧化石墨烯/聚赖氨酸电极具有优良的手性识别能力.因为将L型色氨酸和聚赖氨酸沉积还原氧化石墨烯电极上，并洗脱掉L型色氨酸分子后，电极表面具有L型色氨酸分子的手性空腔，形成了分子印记传感器，同时还原氧化石墨烯和色氨酸对映体通过π-π相互作用，使色氨酸分子能够更加靠近手性传感器，从而L型的色氨酸可以顺利进入手性空腔，与聚赖氨酸相互作用，致使还原氧化石墨烯/聚赖氨酸电极峰电流值下降，但作为对映体的D型色氨酸由于构型不同不能进入手性空腔，峰电流值变化不大.因此与L型的色氨酸的峰电流值相比就会产生明显的差异，从而制备出的传感器展现出良好的手性识别能力.

A：裸电极；B：还原氧化石墨烯；C：还原氧化石墨烯/聚赖氨酸；a：D-色氨酸；b：L-色氨酸.

2.3.2 pH值对ID/IL的影响 为了探究pH值对电极性能的影响，本文用PBS缓冲溶液调节电解液的pH，使电解液的pH为4.8、5.3、6.0、6.5、7.0.从图6看出，随着pH值的不断增大，峰电流比值ID/IL在不断增大.低pH值下的低效率很可能是由于在强酸性介质中还原氧化石墨烯/聚赖氨酸的分解导致识别系统的不稳定.色氨酸的等电位点是5.89，因此当pH值超过6.0时，色氨酸异构体带负电，具有负电荷的L型色氨酸与聚赖氨酸上的基团之间存在静电互斥，而排斥色氨酸与聚赖氨酸作用，降低石墨烯/聚赖氨酸电极的识别效率.因此pH等于6.0时，峰电流比达到最大值，说明试验过程中，检测的电解液pH值等于6.0时，可以获得良好的识别效果.

2.3.3 沉积时间对ID/IL的影响 为了探究沉积时间对电极性能的影响，本次试验采用pH为6.0的PBS缓冲溶液，在沉积时间为1、3、5、7、9 min进行电沉积色氨酸和聚赖氨酸，接着洗去色氨酸.从图7可以看出，随着沉积时间的增加，峰电流的比值ID/IL在不断增加，说明随着沉积时间的增加，沉积到还原氧化石墨烯表面的印迹分子的量增大，提高了识别的灵敏度，到5 min时达到最大.之后随着沉积时间的增长，电极性能不断下降，峰电流比值不断减小，这可能因为过量印迹分子导致整个电极的导电性降低，电极的识别能力降低.试验结果表明电沉积时间为5 min时，L型色氨酸已经在电极上沉积完全，此时的电极具有良好的识别效果.

图6 不同pH对ID/IL的影响

图7 不同沉积时间对ID/IL的影响

2.3.4 试剂样品的检测 在最佳的测试条件下，将分子印迹传感器用于检测由不同含量的D-色氨酸和L-色氨酸组成的浓度为2 mmol/L色氨酸对映体混合溶液.从图8可以看出印迹电极与含0%、20%、40%、60%、80%、100%的L型色氨酸溶液反应后，其峰电流的变化值ΔI与L-色氨酸比例成线性关系，这表明分子印迹传感器对L-色氨酸有着更强的响应性.

ΔI可通过计算公式ΔI=I0-I1计算，I0表示分子印迹传感器的氧化峰电流值，I1表示分子印迹传感器与色氨酸对映体反应后的氧化峰电流值.回归方程ΔI=4.476CD-Trp+4.48(R2=0.992 6)，其R2值较高，表明ΔI与L-色氨酸浓度之间有十分良好的线性关系.说明还原氧化石墨烯/聚赖氨酸分子印迹传感器可利用检测灵敏度很高的差分脉冲伏安法对色氨酸对映体进行手性识别，用于实际分析和测定色氨酸对映体混合溶液中某一构型的含量.

3 讨论

氨基酸作为生命的基本构成物质和多种药物合成的重要前驱体，对其进行手性识别不仅有利于基础科学的研究，更能促进生物医药领域的发展.相比于传统的识别方法，例如光谱法、色谱法等，电化学传感器法具有操作简单快捷、识别灵敏度高、仪器自动化且造价低、能实现在线实时检测以及绿色化学等优点，在手性识别氨基酸领域具有极高的应用潜力，分子印迹传感器作为一类新型的电化学传感器，越来越受到研究者的关注.本研究中手性选择剂是构成传感器最重要的部分，直接起着手性识别的作用.但现有的手性选择剂大都导电能力较差，用于电化学传感时会阻碍电信号的传输，得不到理想的识别效果.石墨烯具有优异的导电性、快的电子转移能力、高的机械强度、良好的化学稳定性等优势，已被广泛用作功能性复合材料的基底.在传感器中石墨烯能提供有效的传感平台，放大电信号，提高传感器的检测灵敏度.相比于直接使用手性选择剂作为传感器，石墨烯作为基底可以和带有吲哚环的色氨酸对映体发生π-π相互作用，使此类手性对映体能够更加靠近手性位点，提升手性识别的效率[24].此外，在石墨烯形成基底后，我们使用电沉积法构筑的整个电化学传感器相比于传统的滴涂法具有更好的电化学稳定性和重复性[25].

图8 ΔI与不同浓度的L型色氨酸之间的线性关系

目前手性识别主要依靠3点作用原理，即手性选择剂与对映体中的种构型依靠分子间作用力形成稳定结合体，而与另外1种构型间则没有相互作用.这种识别方法简捷、高效，但是专一性较差.而分子印记传感器是针对特定分子进行设计的，本研究以聚赖氨酸为功能机体，L-色氨酸为模版分子，在还原氧化石墨烯电极表面采用恒电位沉积和洗脱的方式，制得了对L-色氨酸具有专一手性识别能力的分子印迹传感器，同时探讨出的了最适宜的电极电沉积时间和电解液pH值.

本研究在检测由不同含量的D-色氨酸和L-色氨酸组成的对映体混合溶液时，R2=0.992 6，与文献报道的R2数值0.990 08[26]，0.991 21[27]，0.995[28]等相比具有一定优势，表明其可以用于实际分析和测定色氨酸对映体混合溶液中某一构型的含量.但氨基酸毕竟结构简单，易于识别，我们希望能研究出更多能够精确识别各类手性药物的电化学传感器，手性识别的最终目标将是直接进行手性药物的识别.

4 结论

本文以聚赖氨酸为功能机体，L-色氨酸为模版分子，在还原氧化石墨烯电极表面采用恒电位沉积和洗脱的方式，制得了对L-色氨酸具有手性识别能力的分子印迹传感器，借助DPV、DCV手段对其进行手性识别能力检测.结果表明，5.0 mmol/L色氨酸对映体在分子印迹传感器中ID/IL为4.36，且峰电流的变化值ΔI与L-色氨酸浓度比例成良好线性关系，说明该传感器具有优良和稳定的手性识别能力.此外还原氧化石墨烯能促进电子转移，大大提高了传感器的灵敏性.在实际检测中，电极电沉积时间为5 min，电解液pH值等于6.0时，可以获得最佳的识别效果.本文所制备的分子印迹手性传感器具备对L/D型色氨酸的识别能力，并且制备方法简单，识别准确性和灵敏度高.为识别手性氨基酸提供了构造分子印迹传感器的新策略，能对氨基酸产品或相关药品进行手性类型鉴定或某一构型纯度检测，在生物制药和食品药品检测等领域具有广泛的应用价值.