季铵盐改性聚偏氟乙烯膜抗污染性能及其对厌氧膜生物反应器微生物的潜在影响研究*

2020-07-01虞雪晴张厚强张星冉王志伟

环境污染与防治 2020年6期

陈广虞雪晴张厚强裘湛张星冉王志伟#

(1.上海城投污水处理有限公司，上海 201203；2.同济大学环境科学与工程学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室，上海 200092)

厌氧膜生物反应器(AnMBR)是一项结合了厌氧生物处理技术与膜分离技术的污水处理工艺[1]，具有占地面积小、污泥产量低、能耗低等优点。近年来，由于该项工艺具有产生沼气(甲烷)等优势而愈发受到关注[2]。然而，膜污染是限制AnMBR广泛应用的主要因素之一[3-6]。膜污染主要由溶解性有机物(DOM)、胶体物质及颗粒物在膜表面、膜孔内吸附和聚集而引起[7-8]。膜污染可引起跨膜压差(TMP)的上升，从而降低污水处理效能。生物污染被认为是膜生物反应器(MBR)的重要污染类型[9-11]，主要是由于微生物粘附并在膜面滋生生物膜，导致膜通量下降或者TMP上升[12-13]。

抗菌膜可抑制或延缓膜面的生物污染[14-15]，且不会对成本和膜工艺运行产生显著影响。因此，开发抗污染膜对膜污染控制具有重要的实践价值[16],[17]5086。季铵盐(QAC)是一种杀菌剂，它包含1个中心氮原子和通过共价键连接的4个官能团，其中至少有一个长链烷基。有关QAC杀菌的机理尚未有完全清晰的解释，但目前广泛接受的是QAC通过接触杀灭产生抗菌效果[18]，即QAC可通过将它们的烷基渗透入微生物的细胞膜，改变磷脂双分子层，同时破坏膜的完整性，最终导致胞内物质流出[19-20]。因此，可以采用QAC与聚偏氟乙烯(PVDF)膜共混制备QAC/PVDF膜。虽然已有研究表明QAC/PVDF膜在好氧膜生物反应器中应用时具有一定抗污染能力，且对体系内污染物的去除并无明显不利影响[21]；然而，其在AnMBR中的抗污染性能以及对厌氧微生物活性的影响尚不明确，需进一步探索研究。

本研究采用QAC对PVDF膜改性，探究QAC/PVDF膜在AnMBR中的抗污染性能；将厌氧微生物短期暴露于QAC/PVDF膜的环境中，通过测定其破损细胞比例、厌氧生物处理相关的酶活性(中性蛋白酶和脱氢酶(DHA)活性)、三磷酸腺苷(ATP)及产甲烷性能等，研究QAC/PVDF膜对厌氧微生物的潜在影响，同时考察不同浓度的QAC对微生物活性影响，以分析将QAC/PVDF膜运用于AnMBR的可行性。

1 材料与方法

1.1 QAC/PVDF膜的制备

作为QAC的一种，十二烷基二甲基苄基氯化铵(DDBAC)具有较强的抗菌性和较低的毒性[17]5087，因此选取DDBAC作为抗菌剂，采用相转化法制备QAC/PVDF膜，所用试剂均为分析纯。先将PVDF粉末在 80 ℃ 下烘 24 h以得到干燥的 PVDF。将 PVDF和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解在二甲基亚砜(DMSO)和二甲基乙酰胺(DMAC)混合液中，将以上混合液在80 ℃条件下熟化3～4 d得到均一的溶液a。另取DMSO和DMAC混合液，加入抗菌剂QAC使其充分溶解，得到含有QAC的溶液b。将溶液a用搅拌器搅拌均匀，转速为800～850 r/min，同时将溶液b逐滴加入到溶液a中，温度控制为80 ℃，充分搅拌20～24 h，保证混合均匀。室温下即20～35 ℃真空脱泡30 min，得到均一稳定的铸膜液。将铸膜液于室温下刮制平板膜，在空气中预蒸发30 s后，浸入凝固浴中，保持24 h固化成形，可得到成形的膜。成形的膜在室温下用清水冲洗，最终得到改性的QAC/PVDF聚合物分离膜记为MQ，而未经QAC改性的PVDF膜记为MP，膜编号及膜具体组分见表1。

表1 膜材料成分质量分数

1.2 AnMBR的设计

AnMBR装置如图1所示，AnMBR在室温条件下运行，运行温度为17～28 ℃，将MP和MQ膜组件置于有效体积为1.01 L的AnMBR中，MP和MQ的膜面积均为77.6 cm2。使用N2曝气以保持反应器内部为厌氧状态，通过气体流量计控制曝气强度，多余的气体经AnMBR顶部的排放口排出。研究所采用的厌氧污泥取自曲阳污水处理厂稳定运行的AnMBR，污泥质量浓度为8 g/L，7 d更换一次污泥。膜清洗采用离线清洗方法，将膜取出反应器后在0.05%(质量分数)的NaClO中浸泡清洗2 h。通过反应器连续流运行研究QAC/PVDF膜在AnMBR中的膜污染形成过程，并与空白膜进行对比，分析QAC/PVDF膜抗污染行为。

图1 AnMBR装置图Fig.1 Schematic of AnMBR setup

1.3 细胞活性的测定

利用流式细胞仪(BD FACSVerse)测定破损细胞比例[22]，首先将配制的污泥用0.5%(质量分数)的NaCl溶液清洗3次，每次清洗后离心(8 000 r/min，5 min)，过200目筛网，用0.5%(质量分数)的NaCl溶液将污泥稀释至OD670(670 nm下的吸光度值，其余类推)为0.03后再稀释100倍，在避光条件下，将染料(L7012 LIVE/DEAD®BacLight Bacterial Viability Kit)与去离子水按1∶1体积比混合后再稀释10倍，取0.5 mL稀释污泥于流式细胞管中，加入1 μL染料后在37 ℃摇床以150 r/min转速暗培养15 min后于流式细胞仪在约480、490 nm处观察荧光，细胞膜完整的细胞显绿色荧光，细胞膜残破的则显红色荧光。

采用《蛋白酶制剂》(GB/T 23527—2009)的福林法测定中性蛋白酶，将蛋白酶在碱性条件下用福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680 nm下测定溶液的吸光度，酶活性与吸光度成比例，由此可计算酶活性。酶活定义：1 g 挥发性悬浮固体(VSS)酶液在pH=7.0、40 ℃下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为一个中性蛋白酶活性单位(U/g)。

使用ATP 试剂盒测定ATP浓度[23]。以8 000 r/min转速对污泥样品离心5 min，然后将其重悬于15.4 mmol/L的NaCl溶液中并稀释 50 倍。取100 μL样品加入至白色96孔板中，再加入100 μL试剂盒提供的药剂，混合2 min以裂解细胞，然后静置10 min以使化学发光信号稳定，最后使用多功能酶标仪(Synergy 4)测定其化学发光强度。

DHA活性的测定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法，取0.5 mL污泥用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，在25 ℃下以12 000×g的离心加速度离心10 min，弃上清液，重复3～4次后测定。对照管加0.2 mL Tris-HCl缓冲液，测定管加0.1 mL Tris-HCl缓冲液和0.1 mL TTC-葡萄糖标准溶液，充分混合，在37 ℃暗培养12 h，取出后立即冰浴，加入0.1 mL丙酮，反复振荡数次，37 ℃保温10 min，4 ℃下，以12 000 r/min转速离心5 min，测定485 nm处波长下的吸光度。在37 ℃时，每小时每克VSS样品使每毫升反应体系OD485每增加0.005定义为一个DHA活性单位(U/g)。在DHA和ATP数据分析中，以DDBAC为0 mg/g的组测得的数据作为100%。

1.4 批次产甲烷实验设计

取稳定运行的中试AnMBR内污泥，污泥挥发性悬浮固体(MLVSS)/悬浮固体(SS)约为65%(质量分数)，用0.5%(质量分数)NaCl溶液离心清洗污泥，重复3次，洗去污泥混合液中的本底有机物。用DDBAC固体配制DDBAC储备液(质量浓度为337.50 mg/L)，将储备液稀释成不同的浓度后，取相同体积加入到污泥中，配置一系列的DDBAC溶液，分别为0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00和5.00 mg/g(以1 g SS中的DDBAC质量计)。由于污泥的缓冲作用，各样品的 pH 均在7.2左右。

取25 mL配制好的污泥依次加入134 mL的血清瓶中，MLVSS约为5 g/L。加入预先配好的营养盐(营养盐配方(除HCl，其余以1 L水中的质量计)：NaHCO35 000 mg、NH4Cl 280 mg、CaCl2·2H2O 10 mg、K2HPO4250 mg、 MgSO4·7H2O 100 mg、酵母膏 100 mg、H3BO30.05 mg、FeCl2·4H2O 2 mg、ZnCl20.05 mg、MnCl2·4H2O 0.05 mg、CuCl2·2H2O 0.03 mg、(NH4)SeO3·5H2O 0.05 mg、AlCl3·6H2O 2 mg、NiCl2·6H2O 0.05 mg、Na2SeO3·5H2O 0.1 mg、乙二胺四乙酸(EDTA) 1 mg、刃天青 0.2 mg、36%(质量分数)HCl 0.001 mL)。实验以CH3COONa为基质，称取CH3COONa粉末0.08 g加入血清瓶中。另外，在DDBAC质量浓度为0 mg/g的血清瓶中加入剪取的3.9 cm2MP和MQ以测定产甲烷活性(SMA)和产甲烷潜能(BMP)。用高纯N2吹脱5 min后用橡胶塞密封，放置于35 ℃摇床(100 r/min)中培养12 h后，每隔12～24 h测定血清瓶顶空的气体组分(甲烷和CO2)，连续监测到产气不再增加为止。测定甲烷和CO2的仪器为气相色谱仪(GC 6890N-TCD,Agilent)。根据测得的气体体积作出单位质量VSS产生的甲烷量与对应的时间关系曲线，取前5点作图，求得斜率即为SMA。

为获得BMP，采用修正的Gompertz三因素模型拟合实验得到的甲烷生成曲线[24]。

M(t)=P×exp{-exp[Rmax×e/P×(λ-t)+1]}

(1)

式中：M(t)为累积产生的甲烷量，mL/g；t为反应时间，d；P为最大产甲烷量，mL/g，以1 g VSS产甲烷的体积计，即BMP；Rmax为最大产甲烷速率，mL/(g·d)，以1 d内1 g VSS产甲烷的体积计，即SMA；λ为延滞时间，d。参数P、Rmax、λ采用SigmPlot 12.5进行最小二乘法拟合得到。

1.5 膜面污染物检测

采用激光共聚焦扫描电镜(CLSM，Nikon A1)对膜面进行观察。具体过程为：在膜污染到达终点时(TMP为30 kPa)，将污染膜从膜组件上剪下来(面积为2.25 cm2)。在避光环境中，首先利用 SYPRO Orange(Molecular16 Probes)染色剂对蛋白质染色30 min[25]；再用Concavalin A染色剂对α-多糖染色60 min[26]。用SYTO 9和Propidium Iodide分别对所有的细胞和死细胞染色10 min[27]。每次染色完成后用PBS对样品清洗3 次去除多余的染色剂。染色完成后，用CLSM对样品进行观察。蛋白质在激发波长488 nm、发射波长560 nm下观察；α-多糖在激发波长 561 nm、发射波长580 nm下观察。

2 结果与讨论

2.1 QAC/PVDF膜的性能

图2(a)和图2(b)分别为MP和MQ的扫描电子显微镜(SEM)图像，可以看出MP和MQ表面呈多孔结构，膜表面形貌并无显著差别。图2(c)显示随着QAC的引入，MQ的平均孔径较MP的平均孔径略有增加(分别为(62.43±13.64)、(58.37±9.36) nm)，这是因为QAC 是一种同时具有亲水基团和疏水基团的表面活性剂，在成膜过程中可以起到致孔剂的作用，加速了膜孔结构的形成，从而略微增大了膜平均孔径[28]。图2(d)表明MQ的孔隙率比MP的孔隙率略有增加。因为QAC作为表面活性剂，可在铸膜液中包裹水分子，形成稳定的包裹水的反胶束结构(表面活性剂疏水端朝向聚合物，亲水端朝向水分子)，该反胶束结构的存在可促进非溶剂向铸膜液中的扩散，使凝胶速率加快，且表面活性剂形成的反胶束结构可成为致孔剂，促使MQ孔隙略有增加[29]。

图2 MP和MQ性能Fig.2 Characteristics of MP and MQ

将MP、MQ和对照组(NM，不含膜)浸没在含有大肠杆菌(Escherichiacoli)的营养肉汤培养基中24 h，图3(a)为24 h内的OD600，浸有MQ的大肠杆菌菌液24 h内OD600几乎无变化，稳定在约0.05，而NM和MP的大肠杆菌菌液则在6 h后OD600快速增大，在18 h时达到最大值，最大值大于1.2。图3(b)为大肠杆菌的对数增长期增长系数，含MQ的培养基对数增长期增长系数接近零，而含MP的培养基及NM的对数增长期增长系数为0.18 h-1。与大肠杆菌菌液接触24 h后， MP表面粘附较多的大肠杆菌，而MQ膜面很干净，几乎无大肠杆菌粘附，通过以上分析可知，QAC的引入使PVDF膜具有抑制大肠杆菌(革兰氏阴性菌)生长的特性。

图3 MP与MQ浸没于含大肠杆菌的培养基中膜面细菌生长情况Fig.3 Growth situation of bacteria when MP and MQ were immersed in culture medium containing Escherichia coli

选取金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为革兰氏阳性菌的模型细菌，将MP、MQ和NM浸没在含有金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养基中24 h。图4(a)为24 h内的OD600，浸有MQ的金黄色葡萄球菌菌液24 h内OD600从0.05上升至0.11，上升幅度较小，而NM和MP的金黄色葡萄球菌菌液则在14 h时OD600迅速增大。图4(b)为金黄色葡萄球菌的对数增长期增长系数，含MQ的培养基对数增长期增长系数为0.03 h-1，而含MP的培养基及NM的对数增长期增长系数约为0.16 h-1。与金黄色葡萄球菌菌液接触24 h后， MP表面粘附着大量的金黄色葡萄球菌，而MQ膜面几乎无金黄色葡萄球菌粘附，可知QAC的引入使PVDF膜具有抑制金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)生长的特性。

图4 MP与MQ浸没于含金黄色葡萄球菌的培养基中膜面细菌生长情况Fig.4 Growth situation of bacteria when MP and MQ were immersed in culture medium containing Staphylococcus aureus

通过观测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在含MP和MQ的肉汤培养基中生长情况以及膜面粘附情况，证明未与QAC共混的PVDF膜无抗菌性能，而QAC的引入使MQ具备了抑制细菌生长和粘附的特性，具备了显著的抗生物污染性能。

2.2 QAC/PVDF膜对AnMBR膜污染的影响

图5为MP和MQ在AnMBR中的膜污染情况，MQ的3个清洗周期分别是26、28、24 d，MP的3个清洗周期分别为19、18、15 d，MQ的平均清洗周期较MP延长53%，说明将QAC/PVDF膜运用于AnMBR时，QAC/PVDF膜具有良好的抗污染性能，可延缓膜污染的形成，降低膜清洗频率。MP和MQ最后一个清洗周期较各自的前两个周期有所缩短，主要原因可能是AnMBR的运行温度降低。有研究报道温度的下降会引起膜污染周期的下降[30]，因为在较低温度下，混合液污泥黏度较大，容易沉积在膜面，从而促使TMP增大[31]。从图5可看出，即使在低温条件下，相较于MP，MQ仍然呈现出抗污染性能。

图5 不同运行时间MP和MQ的TMP和温度Fig.5 Variations of TMP and temperature for MP and MQ with time

胞外聚合物(EPS)中多糖具有较高的分子量和更广泛的分子量分布，多糖被认为是EPS中重要组成物质[32]，多糖在MP膜面的沉积显著多于MQ，而在错流过滤中，多糖在膜面的沉积会引起过滤通量的下降，进而引起过滤性能和膜性能的下降[33]，CLSM分析表明，在连续流过滤中QAC/ PVDF膜可减少α-多糖在膜面的聚集，从而延缓膜污染。与此同时，连续流实验后MP膜面的活细胞较多，而MQ膜面则死细胞较多，说明在错流中，QAC/PVDF膜可引起细菌在膜面附近的生长抑制和细胞死亡[17]5091。

2.3 QAC/PVDF膜对厌氧微生物的急性影响

QAC/PVDF膜对AnMBR厌氧微生物的急性影响如图6所示。由图6(a)可以看出，与MP和MQ接触2 h，破损细胞比例几乎与空白组(不含MP或MQ，即为DDBAC为0 mg/g的组)相同。然而，随着游离态DDBAC浓度上升，破损细胞比例由初始的14.4%增大至38.7%，当DDBAC质量浓度低于2.00 mg/g时，破损细胞比例低于22%。而随着DDBAC质量浓度增大至5.00 mg/g，破损细胞比例增大至近40%。有研究表明QAC分子可通过渗透扩散进入细胞膜而使细胞受到破坏[34]，QAC对于细菌细胞壁具有裂解作用[35]。本实验表明厌氧微生物与QAC/PVDF膜的短暂接触(2 h)并不会对微生物细胞造成明显破损，但游离态DDBAC可引起厌氧微生物细胞的破损，其浓度越高对细胞完整性的破坏越强。

图6(b)表明与MQ接触2 h后，厌氧微生物的中性蛋白酶活性与空白组接近，未发生明显变化。当DDBAC质量浓度增大至2.00 mg/g时，中性蛋白酶活性降至低至空白组的约50%，DDBAC进一步增加至3.00 mg/g，中性蛋白酶活性骤降至接近零，即高于3.00 mg/g的DDBAC会使中性蛋白酶失活；而MQ的存在并不会明显影响厌氧微生物的中性蛋白酶活力，中性蛋白酶参与蛋白质的水解[36-37]，游离态QAC浓度上升可引起细胞蛋白质水解功能下降，而MQ对其几乎无影响。

注：横坐标中MP、MQ是指分别加入MP、MQ膜，其余数值为各组中分别加入的游离态DDBAC质量浓度，图7同。图6 不同DDBAC质量浓度下的细胞破损比例及酶活性Fig.6 Ratio of broken cells and activities of enzymes under various DDBAC concentrations

DHA活性变化如图6(c)所示，与MQ接触后厌氧微生物DHA活性与空白组接近。但0.50 mg/g的DDBAC即可引起DHA活性减小，约为空白的80%，1.00 mg/g时DHA与0.50 mg/g时相近，但随着DDBAC浓度继续升高，DHA活性下降至原来的60%以下，在5.00 mg/g时DHA活性仅为空白的24.7%。在较低质量浓度(1.00 mg/g以下)下，DHA活性相对较高，但质量浓度高于1.00 mg/g时，DHA活性下降较为剧烈。类似地，MQ的存在并不会明显影响微生物的DHA活性。

ATP是微生物代谢重要的能量物质，图6(d)表明ATP随着DDBAC浓度增大而下降，在1.00 mg/g以下时的ATP可达空白的80%以上，但当质量浓度高于1.00 mg/g时，ATP明显呈下降趋势，在5.00 mg/g时仅为空白的27%。同样，MQ的存在并不会影响微生物ATP的产生，然而游离态QAC浓度的升高可引起厌氧微生物代谢活性下降。

2.4 QAC/PVDF膜对厌氧微生物产甲烷性能的影响

进一步考察了MQ暴露条件下的SMA和BMP的变化情况，如图7所示，DDBAC质量浓度在0.25 mg/g以下时，SMA和BMP几乎没有减小，随着DDBAC质量浓度上升至2.00 mg/g，厌氧污泥的SMA和BMP呈线性下降趋势，分别由(53.42±3.13) mL/(g·d)和(265.33±3.85) mL/g下降为(2.52±0.79) mL/(g·d)和(15.86±3.93) mL/g。BMP与SMA变化趋势较为一致，而厌氧微生物破损细胞比例(见图6(a))随DDBAC浓度增大而呈增大趋势，SMA和BMP下降及破损细胞比增高共同表明，随着DDBAC浓度增大，DDBAC对厌氧微生物细胞活性的破坏越来越强，浓度的增大可引起细胞失活。此外，与MP和MQ接触的厌氧微生物的SMA和BMP与空白组接近，说明虽然游离态QAC会因浓度不同而对微生物产甲烷能力产生不程度的负面影响，但QAC/PVDF膜并不会对厌氧微生物产甲烷能力产生明显不利影响。