迷迭香酸对三种常见细菌抑菌活性的研究

王 音

(山西师范大学临汾学院 自然科学系，山西 临汾 041000)

0 引言

迷迭香酸(Rosmarinic acid)常见于草本植物中，易溶于水，分子式为C18H16O8，相对分子质量为360.3[1]，具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗肿瘤、抗菌及保护肝脏[4]等作用.目前，各种病原菌耐药性越来越强，细菌的快速传播和极强的适应能力导致人类患病甚至死亡[5-6].中草药是人类宝贵的资源，目前从天然化合物中寻找抗菌试剂是研究的热点内容.因此，本实验研究了迷迭香酸对几种常见细菌的抗菌能力.

1 试剂及主要仪器

1.1 菌种

三种金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和托拉斯假单胞杆菌均来源于山西师范大学临汾学院本实验室保藏.

1.2 药品

迷迭香酸购于成都瑞芬思生物科技有限公司；本实验所用培养基均购于青岛高科园海博生物技术有限公司.

1.3 实验仪器

超净工作台( 尚净，型号: FSF4)；HX-5S恒温循环器(北京惠诚佳仪科技有限公司)；恒温数显摇床( 荣惠，型号: sha-A/B/C)；U-2010 紫外-可见分光光度计(日立)；高压灭菌锅(浙江新丰，型号: XFH-50CA)，CP64C 电子天平(天津市诺顺特科电子仪器公司).

2 实验方法

2.1 最低抑菌浓度(MIC)的测定

参考文献方法[7]，将过夜培养的细菌稀释到特定OD600值，随后用MH培养基稀释500倍.将混匀的菌液取100 μL加入96孔板中，随后加入100 μL不同浓度的迷迭香酸.阳性对照为100 μL菌液加入100 μL MH肉汤培养基，阴性对照为200 μL MH肉汤培养基.37 ℃培养24 h后观察实验结果，肉眼观察未长出细菌、溶液未浑浊的最低浓度为MIC值.

2.2 最低杀菌浓度(MBC)的测定

相同方法培养48 h后涂板[8]，培养基未长出细菌或者菌落数≤10的最低药物浓度即为MBC值.

2.3 杀菌曲线的测定

将细菌菌液过夜培养，稀释到特定的OD600值，稀释1 000倍后，分装到相同的锥形瓶中.加入迷迭香酸，使其终浓度分别为2×MIC、MIC及1/2×MIC.同时设置对照组为不加药的菌液，将锥形瓶放入摇床中，在0、3、6、9、12、24 h分别吸取10 μL涂板.通过固体培养基的菌落数计算总菌落数制成杀菌曲线[9].

3 结果与分析

3.1 迷迭香酸的最低抑菌浓度(MIC)

由表1可知，迷迭香酸对这5种菌均有抑制效果.其中，金黄色葡萄球菌25923在浓度为0.5 mg/mL时有抑菌效果，到1 mg/mL时可以全部抑制金黄色葡萄球菌.但是迷迭香酸对其他两种金黄色葡萄球菌抑制效果较弱，到1.5 mg/mL才能完全抑制.对于单增李斯特菌，当药物浓度高于1.5 mg/mL时出现抑制效果，到2 mg/mL时可完全抑制该菌.托拉斯假单胞杆菌对药物敏感度较高，在1 mg/mL时便可完全抑制细菌.

表1 最低抑菌浓度(MIC)的确定

注:“ - ”无菌生长，“ + ”有少量菌生长，“ + + ”菌数较多.

3.2 迷迭香酸的最低杀菌浓度(MBC)

通过实验得表2.可知，金黄色葡萄球菌8325-4和托拉斯假单胞杆菌的MBC浓度和MIC浓度相同，其他三种菌的MBC浓度相比于MIC浓度均提高了0.5 mg/mL.金黄色葡萄球菌25923、8325-4和单增李斯特菌的MBC值均为1.5 mg/mL，ATCC29213和托拉斯假单胞杆菌的MBC值为2 mg/mL.

表2 最低杀菌浓度(MBC)的确定

3.3 迷迭香酸对三种金黄色葡萄球菌的杀菌曲线

在相同的测量体系中，加入迷迭香酸，分别测定终浓度为0、1/2×MIC 、MIC及2×MIC在不同时间的 Log10CFU/m L值，结果见图1.由图1可知，随着时间延长，三种金黄色葡萄球菌的对照组细菌菌落数不断增长，当培养时间超过12 h时,增长速度减缓并趋于饱和.对于金黄色葡萄球菌25923，迷迭香酸浓度为1/2×MIC和MIC时，起初细菌菌落数不断减少，到12 h后，菌落数反而增加.这说明药物并不能完全杀死细菌，在适宜条件下细菌会重新恢复生长.而金黄色葡萄球菌8325-4，在药物浓度为MIC值时24 h内可杀死所有细菌.金黄色葡萄球菌ATCC29213抑菌效果和25923类似，随着药物浓度增加抑菌效果也越来越强.在2×MIC实验组中，三种金黄色葡萄球菌菌落数都呈现下降趋势，分别在9 h、12h、24 h后完全被杀灭，由此可知，迷迭香酸对三种金黄色葡萄球菌的抑制作用由强至弱分别为25923、8325-4和ATCC29213.

图1 25923、 8325-4和ATCC29213的杀菌曲线

3.4 迷迭香酸对托拉斯假单胞杆菌的杀菌曲线

在相同的测量体系中，加入迷迭香酸，分别测定终浓度为0、1/2×MIC 、MIC及2×MIC在不同时间的 Log10CFU/m L值，结果见图2.由图2可知，迷迭香酸浓度在MIC和2×MIC时都可以杀死所有的托拉斯假单胞杆菌.同时，2×MIC的杀菌效果比MIC效果好，相同时间内菌落数较少.而1/2×MIC实验组可以抑制托拉斯假单胞杆菌的增长.

3.5 迷迭香酸对单增李斯特菌的杀菌曲线

在相同的测量体系中，加入迷迭香酸，分别测定终浓度为0、1/2×MIC 、MIC及2×MIC在不同时间的 Log10CFU/m L值，结果见图3.由图3可知，在12 h内，2×MIC的实验组可以杀死所有的细菌.虽然MIC实验组细菌菌落数显著减少，而1/2×MIC实验组相比不加入迷迭香酸的实验组菌落数也有较大程度降低.

图2 托拉斯假单胞杆菌的杀菌曲线图3 单增李斯特菌的杀菌曲线

4 讨论

迷迭香酸是一种常见的多酚羟基化合物，也是许多中草药的活性成分，主要用于食品[10]、医药[11]及化妆品[12].由于其来源于天然化合物[13]，对人体危害小，因此用于抑菌剂中更加安全.

通过实验发现，迷迭香酸对常见的几种有害菌均有不同程度的抑制作用，具有广谱抗菌活性.通过MIC值比较抑菌效果为单增李斯特菌>金黄色葡萄球菌>托拉斯假单胞杆菌.同时MBC及抑菌曲线实验验证了上述结论.根据汪靖超[14]等人研究，迷迭香酸抑菌机制主要为其可增加细菌生物膜通透性，这会影响糖类、蛋白质等营养物质大量渗漏，导致细菌正常代谢出现问题；同时迷迭香酸也影响蛋白质的活性，如影响关键酶的酶活性等.本实验为迷迭香酸作为抑菌剂提供了理论支持，同时也为今后机制研究提供了基础.