甘草多糖提取分离方法的研究进展*

李 晴，申美伦，李翠芹

（陕西师范大学西北濒危药材资源开发国家工程实验室，药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，生命科学学院，西安 710062）

甘草又名国老、甜草和甜根子等，为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根和根茎，其功效为补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药[1]。甘草多糖是甘草的主要有效成分之一，在医药[2]、食品[3]和养殖业[4]等方面被广泛应用。研究表明甘草多糖具有抗肿瘤[5]、增强免疫[6]和保护肝脏[7]等生理活性。基于甘草明确的药理作用及在食品和养殖业等领域的广泛作用，甘草的需求量不断上升，而甘草资源迅速减少，近年来中国开始从哈萨克斯坦和乌兹别克斯坦等国家进口甘草资源，甘草进口量远远大于出口量[8]。而且，甘草化学成分提取研究备受各国学者青睐，但多数学者只注重三萜类化合物和黄酮类化合物的提取，而提取甘草多糖的研究较少。因此，优化甘草多糖的提取分离工艺以提高其提取率和得率，对甘草资源的综合利用具有重要意义。

通过汇总近10年文献中甘草多糖提取工艺所用的考查指标（见表1），发现存在以下问题：1）甘草原料来源和生长方式混乱，不同品种、不同产地以及不同生长方式的甘草中多糖的含量存在较大差异，因此无法对提取方法进行客观的评判比较。2）甘草原料是否预处理及预处理方法各异（见表2），因此无法评判其对后续提取分离产生的影响。3）不同文献对甘草多糖得率、甘草多糖提取率、甘草多糖含量等计算公式的表述有差异，部分文献得出结果，而未表述其相应的计算公式。

文章通过综述近10年甘草多糖类化合物的提取分离方法，针对目前甘草多糖的提取分离方法现状，如存在甘草原料来源不明、生长方式不清和提取工艺指标混乱等问题，提出解决办法，以期为甘草多糖提取分离的后续研究提供参考。

1 甘草多糖的提取方法

1.1 溶剂提取法 甘草多糖呈中性或酸性[9-10]，故常用水、乙（甲）醇或稀碱等溶剂进行提取。溶剂提取法具有操作简便和成本低等优点，但存在提取时间长（0.5～6 h）、提取温度较高（50～120℃）及溶剂用量大等问题，见表3。

1.2 超声辅助提取法 超声提取技术的原理是利用超声的空化效应、热效应和机械效应，超声的空化效应使植物细胞破裂，热效应使分散介质或药材的温度升高而促使有效成分溶解，机械效应使介质质点产生振动而强化介质的扩散与传质。超声功率、料液比、超声时间和超声温度是该法常见的优化指标，见表4。超声提取方法具有高效节能和操作简便等优点[40]，与传统溶剂提取法相比，超声提取能够缩短提取时间（20～85 min）、降低提取温度（45～90℃）。

1.3 其他提取法 除上述提取方法外，渗流-大孔树脂循环耦合提取法将提取和纯化步骤结合，缩短提取纯化时间，可提取多个有效部位。微波辅助提取可缩短提取时间（4 min），提高提取率，节省溶剂[37]。酶提法作为一种高效、绿色的提取方法越来越受到关注[41]，它是以酶为催化剂通过破坏植物细胞壁从而释放细胞内的有效成分，并且利用酶的特异性和选择性可以在温和条件下反应进而有效保持生物活性物质的生物潜力。超临界二氧化碳（CO2）萃取技术[42]是近十几年发展形成的一项新型萃取技术，因具有无毒、无溶剂残留、处理温度低、选择性强、不易燃、安全等优点被誉为“绿色分离技术”。具体提取条件及优缺点见表5。

表2 甘草预处理的工艺参数

2 甘草多糖的分离纯化方法

2.1 脱色 多糖纯化即将多糖的混合物转化为单一多糖的过程。在多糖纯化前常常先对多糖提取物进行脱色，脱色的方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法（大孔树脂、纤维素、硅藻土、活性炭等）。其中DATE-纤维素脱色较为常用，效果较好[18，27-28，35]。

2.2 去除蛋白质 常用的去除蛋白质的方法有：Sevag法、三氯乙酸法、三氯乙烷法以及醋酸铅加硫酸钠法。这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿∶正丁醇=1∶4[9]，或氯仿∶正丁醇=4∶1[12，16，19，21-22]，或氯仿∶正丁醇=5∶1[10，17-18，20]比例混合，加到样品中振摇。样品中的蛋白质变性成不溶状态，变性蛋白会出现在水相和溶剂相界面之间，用离心法除去变性蛋白质，通常重复使用5次以上能以较高的效率除去蛋白。Zhang等[28]采用Sevag法来去除甘草粗多糖中的蛋白质，重复5次后，测得蛋白含量为6.1%。

2.3 分离纯化 去除上述杂质的甘草粗多糖还需要进一步纯化以得到分子量均一的甘草多糖，甘草多糖的纯化方法主要有分级沉淀法、盐析法、季铵盐沉淀法、金属配位法、凝胶柱层析、离子交换色谱法、超滤法和超速离心法等。针对甘草多糖的特性，可选择不同的分离纯化方法，如根据多糖分子大小和形状的不同，采用凝胶过滤色谱法、膜分离法；根据多糖分子的电荷特性可采用离子交换色谱法；根据多糖分子的极性可采用大孔树脂法，一般选用非极性或低极性大孔树脂。甘草多糖的纯化方法、应用实例及单糖组成列举见表6。

3 前景与展望

目前甘草多糖的提取方法已逐步以节能环保高效为主旨进行优化[22，37-39]，但大多还处于实验室研究、小试或中试阶段，没能改变以传统提取方法为主导的生产现状。因此，由传统提取方法转向其他新方法过程中，如何产业化、降低成本和提高生产效率仍是研究的重要方向之一。

甘草中主要含有皂苷、黄酮和多糖3类活性物质，通常提取甘草酸和甘草次酸等皂苷类或甘草素和甘草苷等黄酮类主要有效成分，提取后的副产物甘草渣当作残渣丢弃，这样不仅污染环境，也造成了甘草资源浪费。虽然，已有研究学者同时提取甘草中总黄酮和总多糖[13]，也有学者对甘草渣[9，38]再提取，但是对于甘草渣中有效成分提取利用关注较多的为黄酮类，对多糖的研究甚少。因此，如何同时提取分离甘草中皂苷、黄酮和多糖3类活性成分，如何对甘草渣再提取，综合利用甘草资源，也是研究的重要方向之一。

表3 溶剂提取法提取甘草多糖的提取工艺参数

表4 超声辅助提取法提取甘草多糖的提取工艺参数

针对甘草药材来源及甘草多糖提取工艺考查指标混乱等问题，可以采取以下方法解决：1）明确甘草原料品种、产地和生长方式，便于不同方法的优化比较。2）正确理解提取工艺相关考查指标的含义，规范考查指标，统一计算公式，选择多指标评价提取工艺的优劣，如浸膏得率、活性成分含量、提取物得率、活性成分提取率。计算公式可作如下规范：

表5 提取甘草多糖的其他方法汇总

表6 甘草多糖的分离纯化及多糖组成

式中：m1为生药材质量（g），m2为浸膏质量（g），m3为含量测定实验中样品活性成分（如甘草多糖）的质量（g），m4为含量测定计算所得活性成分（如甘草多糖）的质量（g），m5为提取物质量（g），W1为生药材中活性成分（如甘草多糖）的含量，W2为提取物中活性成分（如甘草多糖）的含量。