体外受精-胚胎移植不同妊娠结局患者阴道微生态菌群的比较

陈晓燕，张帝开，张敏旗，周 明

(1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011;2.深圳大学第三附属医院(罗湖医院),深圳 罗湖 518000)

体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET )成为不孕症患者寻求自己子女的最后机会。临床医生发现其中一些不孕不育患者并无导致胚胎着床与发育失败的疾病和客观因素，对她们第一次实施体外受精-胚胎移植后发现妊娠仍存在一定的失败率。研究发现多种阴道菌群与不孕症等女性生殖系统疾病存在相关性[1-3]。本研究收集这类人群中妊娠结局不同的体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者阴道分泌物，测序其阴道微生态菌群分布情况，旨在探讨分析阴道菌群分布对第一次体外受精-胚胎移植者妊娠结局的影响，为解决临床问题提供思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2018年1月至2019年12月间深圳大学第三附属医院(罗湖医院)收治的年龄在20～40岁第一次IVF-ET且移植冷冻胚胎患者作为研究对象。

1.2 纳入标准第一次胚胎移植且为冷冻胚胎者；本周期内未曾取卵者；本周期内未进行任何促排卵激素药物使用者；近一周没有性生活史；近一周内无任何给药途径的使用抗生素史；近30d内未进行过阴道用药；近30d内无阴道操作；月经周期正常。

1.3 排除标准伴侣不育并被诊断为精子功能缺陷，如弱精子症、少精子症、严重的少精子症和无精子症；遗传性胚胎疾病、染色体异常、结核病史；可导致上行感染的病原体感染(衣原体，淋球菌等)、阴道炎；术前彩超明确诊断的子宫内膜息肉、子宫肌瘤、输卵管积水、脓肿、严重的盆腔炎性疾病；子宫内膜异位症、子宫腺肌病；宫腔粘连、宫腔纵隔等可能导致胚胎着床失败的客观因素(有上列任何一项者均排除)。本研究经医院伦理委员会审查，本实验研究对象均签署知情同意书。

1.4 实验分组根据样本计算公式及参考文献[4]，选取19例一次IVF妊娠成功者作为妊娠成功组，22例一次IVF着床失败者作为妊娠失败组。

1.5 阴道分泌物采集患者均于内膜转换日前用无菌棉签采集阴道分泌物，每个部位采集 3个平行样品。各部位具体取材方法如下：患者取膀胱截石位，冲洗外阴后，窥器打开阴道，用无菌阴道拭子取阴道后穹窿及阴道上1/3两侧壁分泌物，使阴道分泌物充分包裹于棉签上。取样完毕后将拭子头折断置于2mL无菌冻存瓶中盖上盖子并旋紧置于常温保存液中。

1.6 DNA的提取、PCR扩增及测序使用ALFA-SEQ Advanced Stool DNA Kit(广州)试剂盒，提取阴道拭子上细菌总DNA。对每一个样本总DNA中16SrDNA的V3-V4区域进行PCR扩增，上游引物为5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA -3′下游引物为5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，扩增完成后采用凝胶电泳的方式进行质检。使用NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit(Illumina)试剂盒，完成文库的制备。应用nova-seq6000(Illumina)测序平台，利用双末端测序Pair-end的方法，每条序列从5′ 端和3′端各获得250bp的Pair-end数据。

1.7 比较两组阴道微生态差异分别比较两组患者阴道微生物在属水平上的结构组成及相对丰度。

1.8 统计学方法采用R(v3.6.1)统计学软件进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”表示，计数资料用频数和百分比(n，%)，组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较与妊娠成功组相比(表1)，妊娠失败组患者的年龄、身高、体重、体重指数(body mass index，BMI)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH)、抗苗勒管激素 (Anti-Mullerian Hormone，AMH)及移植胚胎数目均无显著差异(P>0.05)。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组阴道菌群Alpha多样性分析Alpha 多样性的Observed-ASVs、chao1、Shannon、faith_pd指数。Observed-ASVs、Shannon、chao1、faith_pd指数在妊娠失败组和妊娠成功组分别为(44.63±1.47)和(38.72±0.96)、(2.45±0.31)和(1.16±0.23)、(43.23±2.03)和(31.09±1.98)、(5.23±0.74)和(4.02±0.53)，两组各值差异都具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 两组Alpha多样性分析

2.3 两组患者阴道样本微生物在属水平上的结构组成与相对丰度比较如图2所示，妊娠成功组阴道样本微生物属水平结构组成主要为：乳酸杆菌属相对丰度(92.220±1.179)%，加德纳菌属相对丰度(4.967±1.600)%，纤毛菌属相对丰度(1.352±0.358)%，奇异菌属相对丰度(0.833±0.227)%，其他菌属含量较少；妊娠失败组阴道样本微生物属水平结构组成主要为：乳酸杆菌属相对丰度(68.270±1.902)%，加德纳菌属相对丰度(14.940±1.191)%，双歧杆菌属相对丰度(6.048±1.435)%，奇异菌属相对丰度(5.154±1.352)%，纤毛菌属相对丰度(1.166±0.137)%，脲原体属相对丰度(1.136±0.817)%，其他菌属含量较少，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图2 两组患者阴道样本微生物属水平上菌群组成比较

菌属名称妊娠成功组(n=19)妊娠失败组(n=22)tP乳酸杆菌属92.220±1.17968.270±1.90247.5220.000加德纳菌属4.967±1.60014.940±1.19122.8310.000奇异菌属0.833±0.2275.154±1.35213.7420.000纤毛菌属1.352±0.3581.166±0.1371.0430.303脲原体属0.353±0.2241.136±0.8174.0420.000双歧杆菌属0.070±0.0506.048±1.43518.1170.000棒状杆菌0.055±0.0190.869±0.6065.8420.000普氏菌0.035±0.0120.932±0.31612.3440.000链球菌0.089±0.0450.396±0.1896.9020.000丛毛单胞属0.005±0.0010.948±0.6256.5650.000厌氧球菌0.020±0.0130.139±0.0588.7410.000韦荣球菌0.001±0.0000.029±0.0139.3720.000葡萄球菌属0.0009±0.00020.0018±0.00113.5110.001

3 讨论

3.1 阴道微生态菌群失衡与不孕近年来，随着不孕症的发病率的不断上升，引起不孕症的病因更加多样和复杂化。临床上女性不孕主要以女性排卵障碍，输卵管以及子宫腔/子宫内膜等异常因素为主，或男性生精异常及排精障碍等；在某些特殊情况下，沙眼衣原体、淋病奈瑟菌等阴道微生物上行感染可引起上生殖道炎症，也可导致不孕。当前，已有研究者，包括本研究团队关注无导致不孕的明确疾病、自觉健康无临床症状的不孕群体，尤其是阴道/宫腔微生态菌群失衡对女性不孕的影响。

女性阴道微生态菌群的组成不是恒定不变的，受多种外源性或内源性因素影响，从而导致阴道局部环境改变，以及生育力降低[5]。本实验结果显示，妊娠失败组乳酸杆菌的占比比妊娠成功组减少，当阴道内定植的乳酸杆菌减少，菌群多样性增加时，妊娠成功率降低；而妊娠成功组阴道内乳酸杆菌增多。研究表明，当阴道内乳酸杆菌增多时，分解阴道内糖原，产生乳酸，从而降低阴道内PH值，抑制多种病原体生长，有利于胚胎着床。

国内有学者研究了不孕症女性和体检的育龄女性阴道微生态的分布，发现不孕症女性的阴道内微生态失衡者占总人数的70%以上，显著高于体检女性的40%[6]。此外，在阴道菌群失衡的状态下，由于宫颈的开放，阴道内的菌群及寄居宫颈管内病原体，在IVF-ET操作过程中，移植管穿过宫颈进入宫腔的过程，病原体通过污染移植管并被带入宫腔内，影响妊娠结局，且黏液量越多，临床妊娠率越低[7-8]。

因此，阴道微生态失衡的状态对女性不孕/妊娠结局产生不良影响。

3.2 IVF-ET妊娠失败的不孕患者阴道微生态的特性正常孕期女性阴道中乳酸杆菌为优势菌，且阴道菌群多样性比非孕期女性降低，这种条件能够保证孕妇的正常孕育与生产。Ravel 等[9]分析了多个种族女性的阴道菌群发现，约有68.5%女性患有BV，多是因为阴道中有普氏菌存在，这种普氏菌产生大量氨，为加德那菌和消化链球菌的生长提供有利环境，最终造成阴道pH 值升高。同时研究发现，阴道内乳酸杆菌减少、加德那菌和脲原体增加的孕妇早产发生率较高，进而推测早产与阴道菌群ɑ多样性相关[10-11]。这些研究均表明阴道内微生态菌群多样性及乳酸杆菌属丰度对女性的生育力和自然妊娠的结局有一定的影响。

本研究选取排除可能导致胚胎着床失败的疾病及客观因素的IVF-ET患者作为研究对象，应用16s核糖体DNA基因测序的方法分析IVF-ET不同结局下的阴道内微生态菌群分布，从而探讨阴道菌群分布对第一次体外受精-胚胎移植者且为冷冻胚胎移植者妊娠结局的影响。研究结果，通过使用QIIME2软件计算反映Alpha多样性的Observed-ASVs、chao1、Shannon、faith_pd指数，提示妊娠失败组较妊娠成功组的阴道内微生态菌群多样性明显增加：妊娠成功组阴道样本微生物属水平结构组成主要为乳酸杆菌属，其他菌属含量较少，妊娠失败组阴道样本微生物中乳酸杆菌属丰度明显降低，但加德纳菌属、奇异菌属、脲原体属、双歧杆菌属、棒状杆菌、普氏菌、链球菌、丛毛单胞属、厌氧球菌、韦荣球菌、葡萄球菌属相对丰度增加，差异显著。这一结果提示阴道内微生态菌群多样性及乳酸杆菌属丰度对IVF-ET的妊娠结局起着至关重要的作用。

乳酸杆菌在正常阴道菌群中占有主要优势，对维持女性生殖道正常菌群起着关键作用[12]。乳酸杆菌通过将阴道鳞状上皮细胞内的糖原分解成乳酸，使阴道形成弱酸性环境抑制其他致病菌的过度生长；同时采用替代、竞争排斥机制阻止致病微生物黏附于阴道上皮细胞；还可分泌过氧化氢、细菌素、类细菌素等抑制致病微生物生长，从各个方面维持阴道微生态环境的平衡与稳定[13]。正常的受孕是一个自然的过程，女性阴道菌群的多样性及乳酸杆菌的丰度会随着身体状态的改变而发生相应的变化。已有研究表明，阴道微生态菌群紊乱时，乳酸杆菌的丰度下降，会引起其余细菌的繁殖增多。如加德那菌和脲原体等会产生水解酶、弹性蛋白酶以及磷脂酶等造成细胞的破坏，从而使阴道处于一种亚健康的状态[14]，不利于妊娠的结局。此外，有研究者发现子宫也并不是如我们想象的处于一种无菌的状态，而是同样具有一定的微生态环境，当细菌产生的毒素扩散到子宫颈部将子宫颈黏液进行分解，从而导致致病菌透过子宫颈黏液的屏障进入到子宫腔，进而影响子宫内的菌群失调。本研究中，发现IVF-ET妊娠失败的患者阴道菌群失调，是否同时子宫菌群失调，进而引起妊娠失败还需要我们进一步去证实。