基于网络药理学研究络石藤-伸筋草药对治疗骨关节炎的作用机制

蒋涛 孔博 颜威 吴昌桂 徐醒 江敏 奚小冰

摘要 目的：運用网络药理学方法研究络石藤-伸筋草药对治疗骨关节炎的生物活性成分和潜在的作用机制。方法：从中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）和中国科学院化学专业数据库（CASC）中收集已知的络石藤-伸筋草药对中的生物活性化学成分;使用Swiss Target Prediction网络服务器预测化合物的蛋白靶点;从疾病数据库中挖掘已知的骨关节炎相关靶点数据;利用收集到的数据分别构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并提取其交集作为药物-疾病相互作用网络，通过网络拓扑学分析筛选出核心靶点;使用DAVID数据库对核心靶点进行GO注释分析和KEGG通路分析。结果：从TCMSP和CASC数据库中共收集到108个已知的络石藤-伸筋草药对中的化学成分，虚拟筛选后得到17个生物活性化合物，并预测出117个潜在的蛋白靶点;从疾病数据库中一共检索到191个骨关节炎相关靶点;对化合物和疾病的交集PPI网络进行网络拓扑学分析得到208个核心靶点，这些靶点主要富集到自噬、凋亡、炎性反应、雌激素相关的生物过程和信号通路。结论：络石藤-伸筋草药对可能通过多条生物途径发挥调节炎性反应、自噬、凋亡和类雌激素样作用发挥抗骨关节炎作用。

关键词 网络药理学;络石藤;伸筋草;药对;骨关节炎

Potential Mechanism of Herb Pair Caulis Trachelospermi and Herba Lycopodii on Osteoarthritis Based on the Network Pharmacology Study

JIANG Tao1，2，Kong Bo1，2，YAN Wei1，2，WU Changgui1，2，XU Xing2，JIANG Ming2，XI Xiaobing 1，2

（1 Shanghai Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 20025，China; 2 Shanghai Key Laboratory of Prevention and Cure of Bone and Joint Disease by Combined Chinese and Western Medicine，Shanghai 20025，China）

Abstract Objective：To excavate the bio-active compounds and potential molecular mechanism for the herb pair Caulis Trachelospermi and Herba Lycopodii on osteoarthritis （OA） based on the network pharmacology method.Methods：Known bioactive-ingredients of the of herb pair were obtained from the Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） and the Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS，Chemistry Database （CASC） with their potential targets predicted by the Swiss Target Prediction server.Known OA-related genes were mined in disease databases; protein-protein interaction （PPI） network was constructed with the collected data，and their intersection was extracted as drug-disease interaction network; core gene targets were screened through network topology analysis.Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes signaling pathway analysis and Gene ontology analysis were performed to reveal gene function by DAVID database.Results：A total of 108 ingredients of two herbs were retrieved from the TCMSP and CASC databases and 17 of them are considered to be bio-active which yield 117 possible targets.191 OA-related targets were retrieved from the disease database.Network topology analysis of the Drug-disease interaction network yielded 208 core targets，which mainly enriched into inflammation，autophagy，and estrogen-related biological processes and pathways.Conclusion：The Caulis Trachelospermi-Herba Lycopodii herb pair may treat OA through adjusting inflammatory，autophagy and exerting estrogen-like effect，which embodied the multi-component，multi-target and multi-pathway synergy characteristics of traditional Chinese medicine，and provided ideas for further research.

Keywords Network pharmacology; Caulis Trachelospermi; Herba Lycopodii; Herb pair; Osteoarthritis

中图分类号：R285;R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.003

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退化和滑膜炎为特征的骨与关节退行性疾病，临床表现为关节僵硬、肿胀、疼痛、活动受限等[1]。OA在老年人群中发病率较高，严重者可能导致身体残疾，严重影响患者的生命质量[2]。目前OA的药物疗法主要包括口服阿片类镇痛药或非甾体抗炎药、关节腔内注射皮质类固醇等，这些药物通常伴随胃肠道刺激反应，长期使用可能会影响肝肾功能，增加心血管事件的风险，因此许多患者不愿使用[3]。

OA属于中医“痹症”的范畴。络石藤-伸筋草药对是著名中医骨伤流派魏氏伤科治疗风湿痹痛常用的配伍组合，其具有祛风除湿、通痹止痛的作用，在临床治疗OA、慢性腰背痛中有广泛的运用。络石藤是夹竹桃科植物络石（Trachelospermum jasminoides（Lindl.）Lem.）的干燥带叶藤茎，《本草纲目》中记载：“络石，气味平和，其功主筋骨关节风热痈肿，变白耐老”。现代药理学研究表明，络石藤甲醇提取物在体外通过抑制环氧合酶-1，环氧合酶-2，磷脂酶A2和12-脂氧合酶发挥抗炎功效[4]。伸筋草是石松科植物石松（Lycopodium japonicum Thunb.）的干燥全草，《本草拾遗》中记载：“（伸筋草）主人久患风痹，脚膝疼冷，皮肤不仁，气力衰弱”。伸筋草提取物主要发挥镇痛、抗炎、抗氧化的作用[5]。

本研究旨在通过网络药理学方法探索络石藤-伸筋草药对中治疗骨关机炎的生物活性成分及其药理学机制，为后续的研究提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药化学成分虚拟筛选

通过检索“中药系统药理数据库和分析平台”（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库（CASC.http：//www.organchem.csdb.cn.）獲取伸筋草和络石藤的已知化学成分及其药代动力学参数。进而筛选出具有生物活性的化合物纳入研究，筛选标准为化合物口服吸收利用度大于20%（OB>20%），化合物类药性大于0.18（DL>0.18）。口服吸收利用度表示经过口服将特定化合物递送至体循环的能力。类药性指的是一个理想药物应基本具备的特性，是化合物的理化性质以及结构特征的综合反映。

1.1.2 检索OA相关靶点数据

OA相关靶点数据收集自Drugbank数据库（https：//www.drugbank.ca），Therapeutic Target Database数据库（TTD，http：//systemsdock.unit.osit.jp/iddp/home/index），以及DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/）。检索词设定为“osteoarthritis”，种属限定为“homo sapiens”。

1.2 方法

1.2.1 生物活性化合物的靶点预测

从Pubchem数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）中获取络生物活性化合物的标准结构。根据结构相似性原则，使用SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）网络服务器预测可能与生物活性成分相互作用的人类蛋白靶点。

1.2.2 成分靶点网络的构建

利用Cytoscape软件构建一个成分-靶点相互作用网络。网络中的节点代表特定的成分或蛋白靶点，网络中的边代表成分与靶点之间的相互作用。节点的度值（Degree）表示与该节点相连的边的数量，度值越大，说明该节点在网络中更加具有“中心性”。

1.2.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及网络拓扑学分析

为了系统地研究化合物与靶点之间复杂的协同作用，利用上述得到的生物活性成分相关靶点数据和已知的OA相关靶点数据分别构建2个蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络。网络中的节点代表特定的蛋白靶点，网络中的边表示相邻蛋白之间的相互作用。提取2个PPI网络的交集部分构成一个新的交集网络。对交集网络进行网络拓扑学分析，挖掘其核心节点。本研究选用“中介中心性”（Betweenness Centrality，BC），“接近中心性”（Closeness Centrality，CC），“度中心性”（Degree Centrality，DC），“特征向量中心性”（Eigenvector Centrality，EC），“网络中心性”（Network Centrality，NC），“局部平均连通性”（Local average Connectivity，LAC）共6个网络拓扑学参数。首先筛选出DC值大于两倍中位数的节点构成显著交集PPI网络，在此基础上进一步筛选出同时满足BC，CC，DC，EC，NC，LAC分别大于中位数的网络节点构成核心PPI网络。

1.2.4 富集分析

本研究使用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行Gene Ontology（GO）注释分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析。GO注释分析主要包括生物过程（Biological Process），分子功能（Molecular Function）和细胞组成（Cellular Component）3个部分，本研究中我们主要关注生物过程部分。种属限定为“homo sapiens”，P<0.05。

2 结果

2.1 络石藤-伸筋草药对中的生物活性成分及其作用靶点

在TCMSP和CASC数据库中检索“络石藤”和“伸筋草”2个词条，共收集到108个已知的小分子化合物，其中包括34个络石藤化合物，72个伸筋草化合物和2个伸筋草-络石藤共有的化合物。只有17个小分子化合物满足OB>20%，DL>0.18的筛选条件（表1），包括4个来自伸筋草的化合物，11个来自络石藤的化合物以及2个伸筋草-络石藤共有的化合物。这17个小分子化合物被认为是络石藤-伸筋草药对发挥药理作用的主要生物活性化合物。使用SwissTargetPrediction网络平台预测可能与这17个生物活性小分子化合物相互作用的蛋白靶点，去除重复值之后，共收集到117个靶点。选取可与2个以上化合物相互作用的蛋白靶点构建一个“成分-靶点相互作用网络”来揭示生物活性化合物与其靶点的复杂相互作用关系，该网络有77个节点和186条边。大多数小分子化合物能够作用于多个蛋白靶点，大多数蛋白靶点对应一个以上的化合物。其中，酪氨酰DNA磷酸二酯酶1（TDP1），微管相关tau蛋（MAPT），雌激素受体1（ESR1），溶质载体家族6成员2（SLC6A2），腺苷A1受体（ADORA1）的度值大于5（Degree>5），说明分别有5个以上的小分子化合物可以作用于这些靶点。见图1。

2.2 已知的OA相关靶点

以“osteoarthritis”为关键词检索Drugbank，TTD，DisGeNET数据库，分别获得83、20、103个已知的OA治疗靶点。去除重复值后，一共获得191个OA相关靶点，其中有19个靶点与生物活性化合物的靶点重合（图2A）。这表明络石藤和伸筋草配伍使用既能够增加治疗靶点数量，扩大治疗范围，又能协同作用于共同靶点，提高疗效。从图2B中可以看到，木犀草素（Luteolin）、芹菜素（Apigenin）和去甲汉黄芩素苷（Norwogonin）分别能与8个、5个、5个关键靶点发生相互作用，是络石藤中最主要的抗骨关炎成分;6-O-E-阿魏酰筋骨草苷（6-O-E-Feruloylajugol）能作用于6个关键靶点，是伸筋草中的最主要的抗OA成分。

2.3 PPI网络的构建与核心节点筛选

生物活性化合物靶点PPI网络（图3A）有4 121个节点和105 753条边，OA相关靶点PPI网络（图3B）一共有4 553个节点和106 014条边。通过提取2个PPI网络的重叠部分构建交集网络，获得生物活性化合物-OA相互作用的PPI网络（图3C），该网络有2 497个节点和70 933条边。基于之前的研究[8]，筛选出DC值大于两倍中位数（DC>74）的节点作为显著节点，并构建显著交集PPI网络（图3D），该网络具有591个节点和25 557条边。再此基础上筛选出同时满足BC、CC、DC、EC、NC、LAC分别大于中位数的节点作为核心节点，并构建核心PPI网络（图3E）。本研究中，BC、CC、DC、EC、NC、LAC的中位数分别为366.534、0.532、76、0.031、22.448、24.431。核心网络一共有208个节点和7 352条边。

2.4 富集分析

利用DAVID数据库对上述208个核心靶点进行富集分析。其中GO注释分析（图4A）主要得到调节自噬（GO：10 506，P=3.32E-03）、凋亡过程（GO：6 915，P=4.57E-03）、MAPK级联（GO：165，P=2.31E-05）、I-κB激酶/核因子-κB信号传导（GO：7 249，P=8.54E-04）、NIK/核因子-κB信号传导（GO：38 061，P=1.32E-03）等细胞炎性反应、自噬相关的生物过程。KEGG通路富集分析（图4B）主要得到MAPK信号通路（KEGG04010，P=2.04E-05）、HIF-1信号通路（KEGG04066，P=2.85E-05）、PI3K-Akt信号通路（KEGG04151，P=5.65E-05）、FoxO信号通路（KEGG04068，P=2.11E-03）、核因子-κB信号通路（KEGG04064，P=6.46E-03）、Notch信号通路（KEGG04330，P=7.11E-03）、TGF-β信号通路（KEGG04350，P=1.97E-02）等炎性反应、自噬相关信号通路，以及雌激素信号通路（KEGG04915，P=1.10E-06）、GnRH信号通路（KEGG04912，P=8.23E-03）等雌激素相关信号通路。

3 讨论

中医药治疗疾病具有多成分、多靶点、多途径协同作用的特点，是其区别于西药的一大特征[6]。但也由于其多种成分混杂，作用机制不明确等原因受到许多质疑。传统药理学研究方法由于其主要着眼于单个靶点和通路，不能體现中医药的特色，也不符合于中药现代化研究的要求。在国家积极推动中药现代化研究的大背景下，如何在继承和发扬中医药优势和特色的基础上，充分利用好现代科学技术的理论和方法对中药进行深入的研究与开发是当下的难点。网络药理学是一种新兴的药物研发手段。2007年，清华大学李梢教授首先提出基于生物网络的中药方剂研究框架[7]。同年，英国的Hopkins教授提出“网络药理学”（Network Pharmacology）一词，并将其定义为“下一代药物研发模式”[8]。近年来，网络药理学用于中医药现代化研究已经取得了丰富的成果，吸引了多学科研究者的关注。

本研究对络石藤-伸筋草药对中的化合物进行虚拟筛选发现有17种口服吸收利用度高（OB>20%），类药性好（DL>0.18）的小分子化合物能够进入生物体体循环中发挥作用。值得注意的是，虽然相比于络石藤，伸筋草中已经被鉴别出更多的化合物，但是伸筋草中的化合物普遍具有较低的口服吸收利用度，这使得这些化合物比较难进入体循环发挥作用。木犀草素、去甲汉黄芩素苷、芹菜素和6-O-E-阿魏酰筋骨草苷分别能够作用于5个以上抗OA关键靶点，被认为是药对中主要发挥抗OA作用的成分。木犀草素在体外和体内实验中均表现出较好的抗炎活性，其主要通过核因子-κB，MAPK通路发挥作用[9]。Khan等[10]的研究发现汉黄芩苷可以通过ROS/ERK/Nrf2信号通路发挥抗炎和软骨保护作用。芹菜素是一种有效的树突状细胞成熟和迁移抑制剂，在胶原诱导的关节炎模型中可以有效地预防关节炎[11]。其他研究表明芹菜素通过包括核因子-κB，MAPK和蛋白激酶B等多种的信号通路发挥抗炎作用[12-13]。

MAPT靶点可能与络石藤-伸筋草药对中的7种生物活性成分相互作用。MAPT是经典炎性通路MAPK信号通路中的重要节点，Feng等[14]的研究发现细胞内MAPT蛋白水平升高可导致细胞自噬障碍。此外，许多植物类黄酮已被发现可以通过发挥类雌激素样作用改善去卵巢小鼠的骨密度[15]。OA在雌激素水平低于正常值的绝经后老年妇女人群中最为常见，这说明雌激素可能是OA重要的调节因子。来自络石藤和伸筋草的芹菜素、去甲汉黄芩苷、芒柄花黄素、谷甾醇和豆甾醇等都可能作用于ESR1靶点，这表明这些化合物可能具有类雌激素活性。

OA的特征性病理表现是关节软骨的退变，其分子机制主要与软骨细胞的自噬和凋亡有关[16]。自噬可以清除细胞受损的细胞器和失效大分子，是维持细胞内稳态的不可或缺的机制。核心交集PPI网络节点的GO注释分析结果发现，络石藤-伸筋草药对可能可以在调节自噬、凋亡过程等生物过程中发挥作用。此外，KEGG通路分析也发现了该药对可以作用于HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等调节自噬的关键通路。HIF-1信号通路与细胞适应缺氧环境有关，关节软骨中没有血管、神经和淋巴组织，其主要通过滑膜液和软骨下骨扩散至软骨层的氧气和营养来维持软骨细胞的活力，因此关节软骨长期处于一个低氧的状态[17]。HIF-1信号通路在缺氧诱导关节软骨的自噬和凋亡中发挥作用[18]。Zhang等[19]在膝关节炎大鼠模型中发现HIF-1a的表达增高，通过抑制HIF-1a可以改善大鼠滑膜纤维化。Xue等[20]的研究发现，抑制OA大鼠软骨细胞的PI3K-Akt信号通路能够促进关节软骨细胞的自噬，减轻炎性反应。

抗炎疗法是目前临床治疗OA的重要手段[21]。交集PPI网络核心节点的KEGG通路富集分析结果显示，络石藤-伸筋草药对可能通过调节多条通路发挥调节炎性反应的作用，其中主要包括核因子-κB信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、Notch信号通路、TGF-β信号通路等。GO注释分析也发现该药对能调节MAPK级联和核因子-κB信号传导等炎性反应相关生物过程。MAPK信号通路和核因子-κB信号通路是经典的炎性反应通路，许多现有的药物主要通过这2个通路发挥抗OA作用[22-23]。成分-靶点网络中可见络石藤-伸筋草药对中的多个化合物可能可以直接作用于MMP1，MMP2，MMP3，MMP9，MMP13等多个基质金属蛋白酶家族的靶点，这些靶点是MAPK信号通路中的核心节点。此外，FoxO信号通路与细胞应对氧化应激有关，关节软骨细胞中的FoxO的表达会随衰老和关节炎而减少[24]。体内研究表明，OA软骨细胞中FoxO的表达增加能够有效减少炎性反应递质和软骨降解酶的产生，增加保护性基因的表达，并发挥拮抗白细胞介素-1β的作用[25]。TGF-β减少miR140在人体内的活性，miR140是一种miRNA，它能够下调例如MMP13、ADAMTS5等损害关节软骨的基因的表达。全身性抑制TGF-β被认为是抑制OA病理进程的选择之一，但这也将导致健康软骨中TGF-β活性受到抑制，从而损害正常的软骨[26]。

本研究通过网络药理学方法系统地揭示出络石藤-伸筋草药对可能通过多条生物途径发挥调节炎性反应、自噬、凋亡和类雌激素样作用发挥抗OA作用。这一结果符合中医药治疗疾病的多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，同时也说明网络药理学方法运用于中医药研究的科学性和有效性。

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（2020-02-25收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81703576）;上海市中医药三年行动计划项目[ZY-（2018-2020）-CCCX-1011]作者简介：蒋涛（1994.01—），男，硕士研究生在读，研究方向：中医骨伤科研究，E-mail：jt10210@163.com通信作者：奚小冰（1971.07—），男，硕士，主任医师，研究方向：中医骨伤科研究，E-mail：skxixiaobing@163.com