CXCR3、CXCL10在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

郭小卫 潘悦

甲状腺癌是内分泌系统恶性肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤，最常见的病理类型为甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。当前，我国甲状腺癌的发病率和检出率呈上升趋势[2]。趋化因子受体3(chemokine receptor 3，CXCR3)、趋化因子配体 10(chemokine ligand 10，CXCL10)的相互作用与恶性肿瘤发生、发展的关系逐渐引起临床重视[3]。CXCR3与CXCL10相互作用，一方面可通过激活免疫活性细胞或抑制相关血管生成来抑制肿瘤的生长；另一方面也可通过促进肿瘤细胞增殖，分泌蛋白水解酶，诱导血管生成来促进肿瘤的发展和转移[3]。基于此，本研究采用免疫组化法对PTC组织与癌旁正常组织中 CXCR3、CXCL10表达水平进行检测，并分析CXCR3、CXCL10表达与PTC患者临床病理特征的关系，探讨其临床意义，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2018年1至8月在台州市中心医院行手术切除治疗的79例PTC患者的肿瘤组织标本及其相应的癌旁正常组织（距离病灶2cm以上）。其中男37例，女42例；年龄20～72岁，中位年龄41岁。术前所有患者均未接受内放疗或外放疗。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 非免疫性牛血清、兔超敏二步法免疫组化检测试剂、DAB显色试剂均购自福建迈新生物技术有限公司，CXCR3单克隆抗体和CXCL10单克隆抗体均购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化法检测CXCR3、CXCL10的表达 采用SP法分别检测PTC组织与癌旁正常组织中CXCR3、CXCL10的表达。组织标本的石蜡玻片经二甲苯脱蜡，梯度脱水，在体积分数为3%的过氧化氢溶液中室温孵育15min；浸入0.01mmol/L的枸橼酸中，微波抗原修复；用体积分数为10%的非免疫性牛血清封闭，分别加入CXCR3单克隆抗体、CXCL10单克隆抗体，在37℃温箱中孵育1h；加入通用型免疫组化二抗，37℃孵育10min；DAB显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS替代一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判定 细胞膜及细胞质出现淡黄色至棕黄色的颗粒视为CXCR3、CXCL10阳性染色。在高倍显微镜下随机选取5个视野，按照染色细胞数目的多少及显色深浅进行评分[4]。（1）根据阳性细胞着色深浅计分：0分为不显色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。（2）根据阳性细胞所占比例评分：0分为阳性细胞比例＜15%，1分为阳性细胞比例15%～25%，2分为26%～75%，3分为≥76%。以两项得分乘积评定结果，其中0分为阴性（-）；1～3分为弱阳性（+），4～6分为中阳性（++），7～9分为强阳性（+++）。+、++和+++视为阳性表达。

1.3 观察指标 （1）观察并比较PTC组织与癌旁正常组织中 CXCR3、CXCL10阳性表达率；（2）按照 2017年美国癌症联合会（AJCC）关于PTC的TNM分期及患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移有无等情况分成亚组，分析PTC组织中CXCR3、CXCL10的表达与患者临床病理特征的关系。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman秩相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PTC组织与癌旁正常组织中CXCR3表达比较 PTC组织中CXCR3阳性表达率为69.6%（55/79），而癌旁正常组织中CXCR3阳性表达率为25.3%（20/79），PTC组织阳性表达率高于癌旁正常组织，两者比较差异有统计学意见（P＜0.05）。PTC组织与癌旁正常组织中CXCR3表达显微镜下所见见图1（插页）。

图1 PTC组织与癌旁正常组织中CXCR3表达显微镜下所见（a:CXCR3在PTC组织中阳性表达；b：CXCR3在PTC组织中阴性表达；c：CXCR3在癌旁正常组织中阳性对照；d：CXCR3在癌旁正常组织中阴性对照；免疫组化染色，×400）

2.2 PTC组织与癌旁正常组织中CXCL10表达比较PTC组织中CXCL10阳性表达为60.8%（48/79），癌旁正常组织中CXCL10阳性表达率为20.2%（16/79），PTC组织中阳性表达率高于癌旁正常组织，两者比较差异有统计学意见（P＜0.05）。PTC组织与癌旁正常组织中CXCL10表达显微镜下所见见图2（插页）。

图2 PTC组织与癌旁正常组织中CXCL10表达显微镜下所见（a:CXCL10在PTC组织中阳性表达；b：CXCL10在PTC组织中阴性表达；c：CXCL10在癌旁正常组织中阳性对照；d：CXCL10在癌旁正常组织中阴性对照；免疫组化染色，×400）

2.3 PTC组织中CXCR3、CXCL10的表达与患者临床病理特征的关系 PTC组织中CXCR3、CXCL10的表达与患者TNM分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移均有关（均P＜0.05），与患者性别、年龄、肿瘤最大径均无关（均P ＞0.05）,见表 1。

2.4 PTC组织中CXCR3表达与CXCL10表达的关系PTC组织中CXCR3的表达与CXCL10的表达呈正相关（r＝0.597，P＜0.05），见表 2。

3 讨论

趋化因子是一类分泌性小分子蛋白，对不同靶细胞具有趋化和诱导功能，根据特征性保守半胱氨酸基序的排列不同，可分为C、CC、CXC及CX3C共4个亚家族[5]。CXCR3是CXC趋化因子亚家族的受体之一，属于Th1细胞趋化因子受体。CXCR3基因定位于染色体Xq13，cDNA全长1104bp，相对分子质量约为41 000，属于G蛋白耦联受体超家族，共编码368个氨基酸[6]。CXCL10是CXCR3其中一个配体，是一种相对分子质量小的结构相关性蛋白，它通过与靶细胞膜上相应受体结合引起靶细胞的定向迁移[7]。多项研究表明CXCR3及其特异性配体与肿瘤免疫和肿瘤发生、转移密切相关[8-15]。

林明臻等[8]采用免疫组化SP方法检测，发现乳腺癌组织中的CXCR3表达阳性率为 90.0%（72/80），显著高于乳腺纤维腺瘤组的10.0%（2/20）；王晓雅等[9]利用TCGA数据库分析CXCR家族蛋白在不同乳腺癌亚型中的表达，发现CXCR3蛋白在乳腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。Yang等[10]通过蛋白质印迹法检测，发现在人体胃癌组织及细胞系中，CXCR3 mRNA及其蛋白质产物表达水平明显高于癌旁组织，这说明CXCR3在胃癌的发生、发展中发挥重要作用。本研究发现PTC组织中CXCR3高表达，在癌旁正常组织中CXCR3低表达，两组比较有统计学差异，说明CXCR3可能是个潜在的促癌基因，与PTC的发生关系密切，或能作为肿瘤治疗的潜在靶点。

研究发现，CXCL10在早孕绒毛、葡萄胎、葡萄胎恶变以及滋养细胞肿瘤组中阳性表达率逐渐升高，差异有统计学意义[11]。Utsumi等[12]采用免疫组化法检测出肾癌组织中CXCL10的表达水平是正常肾组织的 22倍，CXCR3的表达水平是正常肾组织的6倍，提示CXCR3/CXCL10生物轴在肾癌侵袭、转移中可能起重要作用。本研究发现PTC组织中CXCL10阳性表达率为60.8%，而癌旁正常组织中阳性表达率为20.2%，两者比较有统计学差异，提示CXCL10可能也是个潜在促癌基因，它与CXCR3共同促进了PTC发生、发展。

表1 PTC组织中CXCR3、CXCL10的表达与患者临床病理特征的关系分析[例（%）]

表2 PTC组织中CXCR3表达与CXCL10表达的关系分析[例（%）]

Ma等[13]在75例乳腺癌的研究中发现，CXCR3的表达水平与肿瘤大小、转移累及的淋巴结数呈正相关。Murakami等[14]研究发现，CXCR3高表达可促进结直肠癌淋巴结转移，敲除CXCR3后的结直肠癌肿瘤组织样本发生淋巴结及器官(主要是肝和肺)转移明显减少。而王昌敏等[15]在胃癌中的研究发现CXCR3过表达与肿瘤侵袭迁移率呈负相关，与患者总生存率呈正相关。本研究进一步分析了PTC组织中CXCR3、CXCL10蛋白的表达与患者临床病理特征的关系，发现PTC患者TNM分期病期偏晚、有淋巴结转移的、肿瘤分化程度低的，PTC组织CXCR3、CXCL10表达阳性率均越高。这提示CXCR3、CXCL10在PTC中是促进肿瘤转移的不良指标。

有研究指出乳腺癌细胞高表达CXCR3、CXCL10的原因为乳腺癌细胞能自分泌 CXCL10，且高表达的CXCL10能进一步上调CXCR3的表达，这两者相互作用又可促进乳腺癌细胞增殖，从而进一步导致CXCL10表达上调及CXCR3高表达[16]。本研究中Spearman相关分析显示，PTC组织中CXCR3的表达与CXCL10的表达呈正相关，提示CXCL10作为CXCR3的配体，共同参与了PTC发生、发展的过程。

综上所述，CXCR3在PTC组织中的异常高表达，可能通过其配体CXCL10来实现，但CXCR3是否还通过其他基因来调控PTC的细胞增殖、侵袭、转移，仍需进一步研究。本研究结果提示CXCR3、CXCL10有可能作为PTC治疗的新的潜在靶点。