鱼类卵母细胞减数分裂机制研究进展

史秀兰，徐革锋，黄天晴，谷伟，程琳，姚作春，陈春山，王丽薇，王炳谦

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨150070 2.上海海洋大学水产与生命学院，上海200120 3.北京市水生野生动植物救护中心，北京 102110）

1 鱼类减数分裂分子机制

1.1 减数分裂的启动

目前，人们广泛研究了鱼类减数分裂的启动机制。鱼类在繁衍过程中，为使得亲代与子代的染色体数目恒定，遗传物质稳定遗传，在配子形成中，生殖细胞会发生精确的减数分裂，而鱼类性别决定和生殖细胞的分化正与这过程相关。

减数分裂的启动时间与鱼类性别分化密不可分[1]。对哺乳动物的研究表明，若是形成卵母细胞，减数分裂在胚胎期发生；若形成精母细胞，减数分裂在出生后发生。在13.5dpc（days post copulation，DPC）左右时，雌雄小鼠生殖细胞开始出现形态学差异。这时卵原细胞开始启动减数分裂，在胚胎时，卵原细胞增殖，且已经历了减数分裂的细线期、偶线期和粗线期，之后在雌鼠性成熟时卵母细胞将停滞在双线期，随之在卵泡刺激素、黄体生成素、雌激素等共同作用下，停滞在减数第一次分裂的初级卵母细胞重新启动减数分裂，最终排出成熟的卵子。雄性小鼠与雌鼠不同，精原细胞在胚胎期并不启动减数分裂，在胚胎发生后期就进入静息状态。脊椎动物生殖细胞减数分裂的启动时间与最终发育成卵子还是精子有关[2]。有研究表明，从鱼类生殖细胞减数分裂启动时间来看，雌性明显早于雄性，如尼罗罗非鱼Oreochromis niloticu 雌性卵巢生殖细胞的减数第一次分裂大约在孵出后30d，而雄性精巢生殖细胞到孵化后70d 左右时开始减数分裂[3]。这一结论，还需要进一步探讨。

1.2 减数分裂信号通路

鱼类卵母细胞的发育和成熟是由垂体促性腺激素，卵巢衍生生长因子和性类固醇共同进行复杂的协调。众所周知，类固醇激素，尤其是雌激素和孕激素，分别与卵母细胞生长和减数分裂恢复有关[4]。卵母细胞从减数分裂开始到成熟卵子排出受各通路的调控。这些通路调控着减数分裂的启动、阻滞与恢复，其最新研究进展概述如下。

1.2.1 RA 信号通路

近几年，对哺乳动物减数分裂通路的研究成果（图1）运用到鱼类的研究中，表明视黄酸（Retinoic Acid:RA）可能是MIS（feminizing meiosis-inducing substance，MIS）的类似物[5]，是视黄醇（retinol，ROL）在体内发生代谢后产生的主要活性物质，这种活性对生长发育和机体免疫系统有重要作用，同时若RA 过度增加对细胞的增殖分化有产生抑制作用。RA 的合成分为两步，第一步为以视黄醇为底物发生氧化还原反应，由醇脱氧酶（alcohol dehydrogenases，ADHs）和视黄醇脱氧酶（retinol dehydrogenases，RDHs）进行催化，将ROL 转化成视黄醛（retinal），第二步在视黄酸脱氢酶（RALDH）和RA 合成酶ALDH1A 家族（ALDH1A1、1A2 和1A3）的催化下将视磺醛转化成RA[7]。RA 由肝脏分泌的视黄醇结合蛋白（retinal-binding protein，RBP4）在血清中携带，释放后被周围细胞吸收。而RA 的分解由三种细胞色素P450（CYP26）酶（CYP26A1[8]、CYP26B1[9]和CYP26C1[10]）完成。在细胞色素P450s 酶少或没有时，细胞核RA 受体（retinoic acid receptor，RAR）与RA 结合，促进RA 调控的发育靶基因转录。RAR 与RA 类受体（retinoid X receptors，RXR）形成异二聚体结合到RA 反应元件（RARE）上，所构成的三元复合物通过改变共压因子和与辅激活因子的结合来调控靶基因转录（图2）。蒋汶洮[12]研究发现，罗非鱼中具有完整且独立的RA 的信号通路，雌性罗非鱼减数分裂的起始需要内源RA 的合成，雌激素对性腺中RA 水平也有调节作用，硬骨鱼类和其他脊椎动物的减数分裂可能都需要RA，分解酶或合成酶影响RA 含量。

1.2.2 DHP 信号通路

孕激素（DHP）在生殖细胞发生减数分裂顺利排出成熟配子过程中发挥重要作用。迄今为止，发现具有生物活性的孕激素仅两种，即17,20β-DHP和20β-S。其中，绝大多数硬骨鱼类的孕激素是17,20β-DHP，少数是20β-S[13]。

目前多种硬骨鱼类的核受体Pgr（Progesterone receptors，PGR）已被克隆出来，且细胞表达模式依鱼种类的不同而异[14-16]。Chen 等[14]对哺乳动物细胞系的离体培养试验表明Pgr 最主要的配体是DHP，结合进入细胞核进行转录并激活下游基因的表达。在鱼类卵母细胞减数分裂过程中，成熟促进因子MPF、成熟诱导激素MIH 和促性腺激素LH 三者共同发挥关键的诱导调控作用。三者的作用机制是：促性腺激素进入卵泡滤泡层细胞，在相关的内固醇合成酶作用下合成成熟诱导激素，成熟诱导信号经过环腺苷酸（cAMP）通路驱动成熟促进因子的一个调节亚基的合成途径，由产生的成熟诱导因子作用下游靶基因，使停滞的减数分裂过程得以恢复[17]。在鱼类卵母细胞成熟和成熟卵子排出时期，合成17β-雌二醇（estradiol-17β，E2）到合成DHP 存在迅速转变过程，在排卵前的48h，卵泡会有从分泌E2 到分泌DHP 的转变，在血清中DHP 含量达到峰值时，使得卵子最终成功排出[18]。刘刚[19]报道，核受体Pgr 基因在减数分裂启动的关键时期特异表达于精巢和卵巢中，若阻断了DHP 信号通路，鱼生殖细胞数量显著减少，由此可推断DHP 通过其核受体Pgr 在硬骨鱼类减数分裂启动过程中起到关键作用。

1.2.3 cAMP 信号通路

鱼类性成熟过程中，卵母细胞停留在减数第一次分裂前期，在这期间，高浓度cAMP 协同类固醇激素（如孕酮P4）或其他成熟抑制因子维持减数分裂的停滞。对cAMP 信号通路，即第二信使的雌激素信号通路的研究已经非常透彻了。在卵母细胞减数分裂过程中，Gαs蛋白在其耦联受体3（Gs-protein-coupling receptor 3，GPR3）作用下，活化腺苷酸环化酶（AC）促进cAMP 的合成，使cAMP 在卵母细胞内的浓度变高，减数分裂停滞[20]。黄体生成激素（LH）的释放使GPR3 的配体失活或合成减少，导致GPR3 的活性降低；随后G蛋白受体激酶再通过磷酸化GPR3下调其活性，减数第一次分裂得以恢复。近几年的研究发现，不同生物体内cAMP 信号的通路不同。

研究发现，非洲爪蟾Xenopus laevis 卵母细胞cAMP 通路中，cAMP 降低水平与减数分裂停滞的释放无关；膜通道检测时，cAMP 或PKA 的变化并未随孕酮（P4）的改变而改变，减数分裂停滞后，PKA活性不会发生变化，增加cAMP 水平不会影响卵母细胞成熟的水平[21]。对于硬骨鱼类，体外添加外源性雌二醇（E2）的浓度越高，卵母细胞内检测到的cAMP 浓度越高，从而卵母细胞的成熟受到抑制[22]。研究已证实，E2 主要通过与其膜受体-G 蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）结合来调控鱼类卵母细胞减数分裂的阻滞和恢复。Thomas 等研究发现，用芳香酶抑制剂体外培养的大西洋黄花鱼Micropogonias undulatus 和斑马鱼Danio rerio 细胞自发成熟水平增加，添加外源E2 的作用是可逆的。同样，通过向培养基中添加E2，可以减弱MIS 诱导的卵母细胞成熟[23,24]。手动或酶促剥离卵母细胞卵泡层，以去除其内源性雌激素源干扰，显示出成熟率增加。研究结果表明，这与雌激素对鱼的减数分裂细胞周期进程中的抑制作用一致。

最近的研究表明，在这种通路中，雌激素对鱼卵母细胞成熟的抑制是通过其跨膜受体，即GPER介导的。继哺乳动物研究之后，Peyton 和Thomas 的研究表明，雌激素对卵母细胞成熟的抑制作用是通过Gper 介导的[25]。GPER 先前定位于卵母细胞表面，在卵母细胞表面高度表达。Peyton 和Thomas 证实[26]，缺乏雌激素的斑马鱼卵母细胞表现出高度的自发成熟。添加E2-牛血清蛋白（不含膜的雌激素）阻断了卵母细胞的自发成熟。进一步的研究表明，GPER特异性激动剂（G-1）减弱了自发性卵母细胞的成熟，且GPER 特异性拮抗剂（G-15）阻断了E2 对卵母细胞成熟的抑制作用。脊椎动物（哺乳动物和鱼类）的验证表明，GPER 的基本功能作为膜雌激素受体这一观点取得了更有力的支持[27]。

2 鱼类减数分裂特异性基因

近几年，关于Stra8、Scp3、Dmc1 和Spo11 等减数分裂特异性基因的研究逐渐增多，相关信号通路的验证往往与特异性基因分不开。研究者们致力于探究减数分裂各个时期的启动时间、发生过程以及各通路之间的相互影响和作用的同时，也在寻找与减数分裂相关的特异性表达基因。这里着重介绍几个调控鱼类减数分裂的特异性基因。

对哺乳动物和鸟类的研究发现，有丝分裂结束开始减数分裂前，Stra8 基因是这时期的特异性表达基因，在调控减数分裂的起始过程中起非常重要的角色。若Stra8 缺失，生殖细胞将不能完成减数分裂[28-30]。早期，对青鳄Crocodylus siamensis、斑马鱼Danio rerio、红鳍东方鲀Takifugu rubripes 和黑青斑河鲀Tetraodon nigroviridis 等的基因组序列分析中，并没有发现Stra8 的同源基因[31]。近几年，焦静等[32]从几种硬骨鱼类，如沟鲇Parasilurus asotus、虹鳟Onchorrhychus mykiss 等鱼中分离到了基因Stra8，其在性腺中特异性地表达，说明Stra8 基因在减数分裂启动中的重要作用。

Dmc1（Disrupted meiotic cDNA）是在减数分裂前期偶线期表达的特异基因,其表达产物为同源染色体配对时所必需。Dmc1 蛋白在真核生物中发现，是大肠杆菌Escherichia coli RecA 蛋白的同源蛋白。Dmc1 基因是减数分裂重组和联会复合体（Synaptonemal complex,Sc）的关键组分[33,34]。早期研究人员发现DMC1 蛋白是哺乳动物细胞减数分裂特异的重组蛋白，仅在精原细胞和胚胎时期的卵母细胞中表达。小鼠Dmc1 基因在减数分裂Ⅰ细线期到偶线期的过程中特异表达，为同源染色体联会配对必需[35]。若Dmc1 基因突变或者被敲除，直接导致减数分裂停滞在偶线期，不出现同源染色体联会或者出现异常联会[36]。在鱼类研究中，如日本鳗鲡Anguilla japonica、红鲫Carassius auratus red var.、湘江野鲤Cyprinus carpio L.、日本白鲫Carassius cuvieri、湘云鲫和鲫鲤等鱼类中发现，Dmc1 基因仅在减数分裂间期早期表达[37]。在陶敏等研究发现，Dmc1 基因在不同倍性鲫鲤中的表达与倍性无显著相关性[38]。

联会复合体（Synaptonemal complex，SC）是一种框架状结构的蛋白复合体，发生在配子形成过程中减数分裂偶线期同源染色体配对时形成的一种核内临时结构[39]。这种联会复合体蛋白质（Synaptonemal complex protein，SCP）由Scp1、Scp2 和Scp3 三种蛋白构成[40-42]。其中Scp1 是主要构成SC 的中心和轴向蛋白[43,44]。而Scp2 和Scp3 则是主要组成SC 的横向蛋白[45-47]，其中Scp3 具有DNA 结合位点，广受学者们的关注。SCP 最早在减数分裂前期的细线期形成，双线期消失；SCP 与同源染色体的凝集、配对、重组以及双链断裂密切相关[48,49]。若SCP 基因缺失，减数分裂不能进入后期或出现非整倍体配子。近几年，研究者们已经分析和验证了哺乳动物如大小鼠、牛、绒山羊等以及人的Scp3 基因功能。在硬骨鱼类中，目前在虹鳟[50]、青鳉Oryzias latipes[51,52]、斑马鱼等模式鱼中有研究，证明Scp3 基因仅在性腺中表达，可作为减数分裂特异性标记基因。

Spo11 是减数分裂粗线期染色体重组过程中不可或缺的蛋白，参与DNA 双链断裂复合物（Double-Strand breaks，DSB）的形成。近几年，已在多种脊椎动物克隆了Spo11 基因，可推断此基因可能在其他物种减数分裂进程中具有保守功能[53，54]。但在日本鳗鲡Anguilla japonica 中发现，Spo11 基因仅在精母细胞中有表达，而在卵黄发生早期没有发现[54]，表明Spo11 基因在硬骨鱼类的表达模式与其他物种并不完全一致。尚婉婧等[55]对尼罗罗非鱼的研究表明，Spo11 基因仅在性腺特异性地表达，且雌性生殖细胞的表达早于雄性。Spo11 基因适合作为性腺分化早期，生殖细胞减数分裂的标志基因。

3 展望

近年来，对卵母细胞减数分裂过程调控机制的研究日益增多，面对这一应用基础领域的热点及难点，国内外学者们不只局限于植物和哺乳动物的研究，在两栖动物如爪蟾，硬骨鱼类的探究也越来越多。多倍体鱼类不育，在生长过程中较正常二倍体具有更多的生长优势。研究二者在减数分裂过程中的差异是关键的一步。减数分裂的启动过程，与鱼类性别分化和性腺发育的关系密不可分，从这一方面入手，有利于实现人工控制鱼类倍性，对提高生产经济效益有突出贡献。