4 种常用水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的急性毒性

程剑，罗鸣钟，魏巍，李锐

（1.上饶幼儿师范高等专科学校，江西 上饶 334000；2.长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；3.浙江省农业科学院，省部共建农产品质量安全国家重点实验室（筹），浙江 杭州 310021）

黑斑蛙Rana nigromaculata 是我国分布最广的水产养殖两栖动物之一，具有重要的经济价值[1]。2018年，我国蛙类总产量已超过10 万t，比2017年增长了11.57%，在全国水产养殖总产量中增长迅速[2]。黑斑蛙肌肉中粗蛋白含量高于中国林蛙R.Chensinensis、虎纹蛙R.tigrina、棘胸蛙R.spinosa等经济蛙类，而脂肪含量仅为0.35%，鲜味氨基酸含量高于牛蛙R.catesbeina，具有高蛋白、低脂肪、味道鲜美的特点[3,4]。水域生态环境污染以及过度捕捞使黑斑蛙自然资源量急剧减少，1989年野生黑斑蛙已列为我国的二级野生保护动物。黑斑蛙的人工养殖业逐步发展起来，主要以稻田围网、仿生态养殖为主，也有池塘精养、大棚养殖等模式。药物和水产消毒剂如高锰酸钾、硫酸锰等的滥用，严重影响了黑斑蛙养殖业的发展。

黑斑蛙为两栖动物，皮肤具有渗透水分和交换气体的能力，其繁殖活动和幼体（蝌蚪）发育均在水中进行，水域的污染直接影响其生长、生殖、发育、内分泌的调节和血液循环等。黑斑蛙蝌蚪阶段细胞分裂旺盛，对环境的变化极为敏感，因此常用作水环境质量指示生物[1,5-7]。目前，利用黑斑蛙蝌蚪及胚胎评估化学品生态毒性，已有大量研究。急性毒性研究发现，常见重金属离子对黑斑蛙蝌蚪的毒性大小依次为：Hg2+＞Cu2+＞Cd2+＞Cr6+＞Pb2+[8]；养殖实验也表明，随着镉离子浓度的升高，蝌蚪的体质量和长度的增长率降低，完全变态所需时间增长[9]。在农药杀虫剂方面，报道了氯氰菊酯[10]、三唑酮[11]、环丙唑醇[12]、甲胺磷[13]、三氯杀螨醇[14]和异噻唑啉酮类杀菌剂[15]等对黑斑蛙蝌蚪的急性和慢性毒性效应。有机化合物双酚A[5]、壬基酚[6]、苯胺[7]、离子液体[C8mim]Br[16]等的毒性也做了研究。

消毒剂在水产养殖中发挥着重要作用，主要用于养殖水体清塘、苗种下塘前药浴、疾病防治等，合理、科学使用消毒剂，能有效杀灭养殖环境中的病原微生物，防止疾病的发生。目前，关于硫酸铜、聚维酮碘、高锰酸钾[17]、氯化钠等常见消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的急性毒性研究罕见报道。

通过了解常用水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的毒性效应，对于规范用药，完善黑斑蛙生态繁养技术具有重要的实践意义。本实验采用半静态水生生物急性毒性实验法，研究生产中常用的硫酸铜、聚维酮碘、高锰酸钾和氯化钠对黑斑蛙蝌蚪的急性毒性效应，得出半致死浓度、安全浓度以及药物毒性蓄积程度系数，以期为黑斑蛙野生资源的保护以及人工繁育技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用蝌蚪体质量为（0.31±0.04）g，体长为（2.55±0.27）cm，由长江大学水产基地提供，暂养于实验室塑料箱中，用曝气的自来水，连续充气，温度为（20.0±1.5）℃，pH 为（7.25±0.25），溶氧≥6.0mg/L，光照周期12 h 光照∶12 h 黑暗。挑选外观正常，体质健康，规格接近的个体用于实验。

聚维酮碘购自山西华坤生物科技有限公司，有效成分10%；硫酸铜、高锰酸钾和氯化钠购自湖北康盛医药科技有限公司，分析纯，有效成分99%。按4 种消毒剂的使用说明上的有效浓度用双蒸水配置母液，实验时由母液稀释成试验液。

1.2 方法

48h 的预实验得出蝌蚪的最大无死亡质量浓度和全部致死浓度。依此设计了6 个等对数间距的实验质量浓度梯度（表1）。每组设3 个平行组，1 个空白对照组，每组10 尾蝌蚪。

实验期间不投饵，每隔24h 更换药液1 次，实验期间各组水质一致。实验采用半静态方式水生生物急性毒性实验法[18]。实验开始后12h 连续观察蝌蚪的反应及运动情况并记录，在24h、48h、72h、96h观察蝌蚪的死亡数据并及时清出死亡个体。

表1 4 种水产消毒剂的实验浓度Tab.1 The concentrations of four aquaculture disinfectants in the experiment

1.3 数据处理

采用寇式法（Karber）计算半致死浓度（LC50）、安全浓度（SC）和半致死浓度的95%置信区间（CI），并以实验浓度的对数为横坐标与死亡率为纵坐标做直线回归方程[18]，利用药物毒性蓄积程度系数（MAC）来分析蝌蚪体内对药物蓄积和降解的变化，相关计算公式如下：

半致死浓度（LC50，mg/L）：LogLC50=Xm-d（∑p-0.5）；

安全浓度（SC，mg/L）：SC=48hLC50×0.3/（24hLC50/48hLC50）2；

半致死浓度95%置信区间（CI，mg/L）：95%CI=LogLC50±1.96×d［∑（pg/n）］0.5；

药物毒性蓄积程度系数（MAC，%）：MAC=100%×（t1LC50-t2LC50）/（t0LC50-tmLC50）。

上式中：Xm为消毒剂最大浓度的对数，d 为相邻浓度的对数差值，P 为死亡率（%），∑p 为各组死亡率之和，g 为存活率（%），n 为每组实验蝌蚪的尾数；t1LC50和t2LC50为t1和t2时的半致死浓度值（mg/L），t0LC50和tmLC50分别为实验初始和结束时半致死浓度（mg/L）。

2 结果与分析

2.1 中毒症状

实验前6h，4 种水产消毒剂高浓度组（浓度Ⅴ和Ⅵ）的蝌蚪开始兴奋，游动迅速、上下搅动水体、趋边游动或冲撞塑料箱沿壁；高锰酸钾组中蝌蚪反应较为强烈，剧烈游动，肛门有浅红色丝状粘稠物排出，体表出现粘液；中低浓度组（浓度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）的蝌蚪出现应激反应，如浮头、静止不动、呼吸不畅等症状，但过一段时间后逐渐恢复正常状态，而氯化钠组中蝌蚪分泌粘液最为明显。6h 后高浓度组的蝌蚪身体逐渐地失去平衡，漂浮于水面，呼吸逐渐减弱，身体扭曲，翻转，游动缓慢，有部分侧翻，最后沉底死亡。4 种消毒剂中死亡蝌蚪症状存在不同：硫酸铜组中毒死亡的蝌蚪腹部膨大，嘴部出现白色絮状黏浊物，尾部僵硬弯曲，逐渐脱水，体积缩小，体色呈淡蓝色；聚维酮碘组中毒死亡的大部分蝌蚪肛门有粪便排出；高锰酸钾中死亡个体尾梢上翘，缩水变小，蝌蚪体色微呈淡红色；而氯化钠组中毒死亡的蝌蚪脱水严重，体型缩小明显，尾部弯曲，泄殖孔排泄出白色的絮状粘稠物，体表有大量粘液附着。

表2 4 种水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的致死率Tab.2 Mortalities of tadpoles of frog R.nigromaculata exposed to the four aquaculture disinfectants

2.2 急性致死效应

在96 h 的急性毒性实验中，对照组的蝌蚪均未发生死亡，各消毒剂处理组蝌蚪的死亡率随药物浓度增加、实验时间的延长而上升（表2）。

低浓度组（浓度Ⅰ和Ⅱ）的氯化钠对黑斑蛙蝌蚪的急性致死效应最小，96 h 的死亡率不超过10%；高锰酸钾的急性致死效应较小，96 h 的死亡率为36.67%；硫酸铜和聚维酮碘对黑斑蛙蝌蚪的急性致死效应较大，96 h 的死亡率均超过为50%。中高浓度组（浓度Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ）中，四种水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的急性致死效应较大，96 h 时各组均存在100%的死亡率。在最高浓度的实验中，除24 h时的聚维酮碘，其余时间各组均100%死亡。

2.3 半致死浓度和毒性蓄积效应

硫酸铜、聚维酮碘、高锰酸钾、氯化钠对黑斑蛙蝌蚪的24h、48h、72h 和96h 的半致死浓度LC50、半致死浓度的95%置信区间CI、药物毒性蓄积程度系数MAC 和安全浓度SC 见表3。由表3 可知：半致死浓度均随实验时间的延长而下降，硫酸铜对黑斑蛙蝌蚪24h、48h、72h 和96h 的半致死浓度分别为3.503 mg/L、3.061 mg/L、2.183 mg/L 和1.689mg/L，聚维酮碘为20.261 mg/L、15.489 mg/L、10.864 mg/L 和9.347mg/L，高锰酸钾 为3.221 mg/L、2.109 mg/L、1.905 mg/L 和1.803mg/L，氯化钠为8818.652 mg/L、8298.550 mg/L、7928.583 mg/L 和7348.559mg/L。安全浓度由低到高为：高锰酸钾＞硫酸铜＞聚维酮碘＞氯化钠。四种水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的药物毒性蓄积程度系数（MAC）随实验时间延长而产生的变化存在差异。聚维酮碘和高锰酸钾的MAC 值随实验时间的延长而下降，聚维酮碘下降较慢，而高锰酸钾下降较快。硫酸铜和氯化钠的MAC 值在96h 内变化相反，硫酸铜先升高后降低，氯化钠先降低后升高。

根据药物浓度对数和死亡率-概率单位的关系计算出4 种药物24h、48h 和96h 的回归方程（表4）。

表3 4 种水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的急性毒性特征分析Tab.3 Analysis of acute toxicity of four aquaculture disinfectants to tadpoles of frog R.nigromaculata

表4 4 种水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的回归方程Tab.4 Regression equations of four aquaculture disinfectants to tadpoles of frog R.nigromaculata

3 讨论

3.1 4 种水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的急性毒性特征

半致死浓度（LC50）是评价药物对水产动物急性毒性的重要指标，根据国家环境保护总局发布的毒性分类标准[20]，急性毒性96hLC50＜0.1mg/L 为剧毒，0.1～1.0mg/L为高毒，1.0～10.0mg/L 为中毒，＞10.0mg/L为低毒。本实验结果显示：氯化钠对黑斑蛙蝌蚪的96hLC50为7348.559mg/L 属低毒药物，硫酸铜、聚维酮碘和高锰酸钾的96hLC50分别为1.689mg/L、9.347mg/L 和1.803mg/L，均属中毒药物。4 种水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的毒性由强至弱依次为：硫酸铜＞高锰酸钾＞聚维酮碘＞氯化钠。

在本试验中，硫酸铜对黑斑蛙蝌蚪的96hLC50为1.689mg/L，换算为Cu2+对黑斑蛙蝌蚪的96hLC50为0.676 mg/L，高于泽陆蛙Fejervarya multistriata（0.118 mg/L）[22]、牛蛙（0.24 mg/L）[23]、中华蟾蜍Bufo gargarizans（0.3625 mg/L）[24]，而低于昆明裂腹鱼Schizothorax grahami（2.275 mg/L）[25]、厚颌鲂Megalobrama pellegrini（4.45 mg/L）[26]。黑斑蛙蝌蚪对硫酸铜的耐受性在无尾两栖类蝌蚪中较高，与鱼类幼苗比较，则耐受性较差。在本试验中，聚维酮碘对黑斑蛙蝌蚪的96 h LC50为9.347 mg/L，低于葛氏鲈塘鳢Perccottus glehni（65.7 mg/L）[27]、暗纹东方鲀Takifugu obscurus （151.09 mg/L）[28]、大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus（388.47 mg/L）[29]。在本试验中，高锰酸钾对黑斑蛙蝌蚪的96hLC50为1.803 mg/L，低于昆明裂腹鱼（2.267 mg/L）[25]、厚颌鲂（5.28 mg/L）[26]，高于褐鳟Salmo trutta（0.75 mg/L）[30]，而与鳜Siniperca chuatsi（1.80 mg/L）[31]接近。在本试验中，氯化钠对黑斑蛙蝌蚪的96h LC50为7348.559 mg/L，即7.35 g/L，低于福寿螺Pomacea canaliculata（11.64 mg/L）[32]。

3.2 4 种水产消毒剂在黑斑蛙蝌蚪体内的蓄积与降减的特征分析

在研究生物对毒物的蓄积与降减动态时，常用MAC 即药物毒性蓄积程度系数作为生物对毒物敏感程度差异的指示参数[19]。一般认为，MAC 为正值时，蓄积作用强于降减作用，MAC 为负值时，降减作用强于蓄积作用；MAC 值越大，即毒效蓄积幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大。

对4 种水产消毒剂的比较发现，MAC 最大和最小值均出现在高锰酸钾实验中，表明黑斑蛙蝌蚪对高锰酸钾敏感性较强，其降解毒效能力也较强。在48～72h 实验中，蝌蚪对聚维酮碘的MAC 值下降明显，48～72h 的MAC 值是24～48h 的18.27%；在72～96h 实验中，蝌蚪对聚维酮碘的MAC 值下降明显，72～96 h 的MAC 值是48～72h 的32.82%，说明其降解毒效能力较强，毒效蓄积速度下降，聚维酮碘实验尤为明显。实验在各时间段，黑斑蛙蝌蚪对硫酸铜和氯化钠的蓄积幅度较为均衡，说明其毒效蓄积较强，降解毒效能力较差。因此，建议在探讨药物对生物的毒性效应时，应分析药物毒性蓄积变化，充分考虑时效性才能更全面评估药物的毒性效应。

3.3 4 种水产消毒剂对黑斑蛙蝌蚪的用药安全

水产消毒剂主要用于苗种、养殖水体和生产用具的消毒灭菌，定期使用消毒剂类药物是预防出血、烂鳃等细菌性疾病以及寄生虫病的有效方法。本实验中，黑斑蛙蝌蚪对硫酸铜的安全浓度为0.701 mg/L，与全池泼洒的常用剂量为0.75 mg/L 相当，理论上可以使用硫酸铜作为黑斑蛙蝌蚪疾病治疗的渔药，但考虑到重金属铜离子可在生物体内积累，因此在养殖生产实践中应慎用。聚维酮碘的安全浓度为2.715 mg/L，在全池泼洒常用剂量2～4mg/L 范围内，可以使用。高锰酸钾的安全浓度为0.271 mg/L，远低于生产上常用的泼洒浓度（1～2mg/L），不建议使用高锰酸钾泼洒消毒。目前，生产上仅用氯化钠下塘前浸泡消毒苗种，而少见用于水体泼洒。氯化钠在水中溶解度高，造成水体盐度变化，不仅作用于水产动物的渗透压调节，还刺激或抑制其摄食、新陈代谢及激素传导等[33]。不同淡水生物对盐度的适应性不同，如弓斑东方鲀Fugu obscurus[34]、小锯盖鱼Centropomus parallelus[35]和金鱼Carassius auratus[36]在低盐度时特定生长率和饲料转化率较高，而花鳗鲡Anguilla marmorata 和太平洋双色鳗鲡A.bicolor pacifica 在淡水中生长良好，在盐度5、10 和18 水体中生长受抑制[37]。氯化钠来源广，价格便宜，研究低盐度的泼洒消毒以及对水生动物生长的影响，具有重要的实践意义。

基于本研究结果，建议在黑斑蛙蝌蚪消毒以及疾病防治中，使用聚维酮碘安全，硫酸铜需慎用，高锰酸钾不宜使用，而氯化钠可浸泡使用，泼洒使用尚需进一步研究。黑斑蛙蝌蚪对毒物反应敏感性高于一般鱼类苗种，有良好的剂量与效应关系，用黑斑蛙蝌蚪辅助传统的理化监测仪器监测水质，能在一定程度上反映出环境污染的综合生物学效应。利用黑斑蛙蝌蚪作为模式生物，进行急性毒性试验，对于规范我国水产药物的毒性评价具有一定意义。