染色体脆性位点以及全新普通型脆性位点基因FATS的研究进展

张 军,郑向前,高 明*

(1.天津医科大学肿瘤医院 乳腺二科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津300060;2.天津医科大学肿瘤医院 甲状腺颈部肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060)

肿瘤学研究包括发现新的抑癌基因并探讨抑癌基因在肿瘤发生发展过程中的作用机制。染色体脆性位点(fragile site)是正常基因组中位点特异的不稳定区域，包括稀有型脆性位点(rare fragile site)和普通型脆性位点(common fragile site,CFS)，稀有型脆性位点与肿瘤的关系并不明确，然而普通型脆性位点与多种肿瘤基因组变异位点相一致，它们与肿瘤的发生发展密切相关。但是由于缺少鉴定CFS的方法，其生物学功能以及作用机制仍不清楚。进化上保守的CFS与肿瘤发生密切相关，发现并阐明CFS基因生理功能以及调控机制，对于推动癌症病因学，肿瘤发生发展的研究，以及肿瘤分子诊断和风险预测具有重要意义，本文对染色体脆性位点以及全新普通型脆性位点基因 FATS(fragile-site associated tumor suppressor)的研究进展进行综述。

1 染色体脆性位点(fragile site)

1.1 染色体脆性位点

染色体脆性位点(fragile site)包括39个稀有型脆性位点(rare fragile site)和88个普通型脆性位点(common fragile site,CFS)[1,2]。1984年普通型脆性位点被发现[3]，当受到某些因素的作用时DNA复制被抑制，染色体会在有丝分裂中期形成缺口或断裂区。叶酸可以诱导稀有型脆性位点的出现，但是仅在少数人群(小于2.5%)的基因组发生，其与三核苷酸重复序列的扩增有关 (例如FA RXA 基因CCG重复扩增导致脆性X-染色体综合症)，稀有型脆性位点与癌症无相关性。与稀有脆性位点不同，CFS可以在所有个体的染色体基因组中被诱导[1]；CFS进化上保守[2,4]，研究热度越来越高主要有两个原因：首先，导致CFS形成的因子和条件可以被鉴定；其次，CFS与肿瘤(包括癌基因)中的周期性染色体重排相关联，CFS可能是导致染色体重排的重要原因[5]，是肿瘤发生或肿瘤进展的驱动因素[6]。Casper等[4]研究表明：ATR是参与DNA损伤反应信号传导的细胞周期节点蛋白，ATR激酶调控CFS位点的稳定性，但是同样参与DNA损伤反应信号传导的细胞周期节点蛋白ATM却不参与CFS稳定性的调控，提示DNA损伤反应信号传导通路与CFS区域的基因组稳定性可能存在着错中复杂的关系；近年来，研究发现CFS经常位于DNA迟复制区，一个普通型脆性位点FAR3B顺序迟复制，在诱导剂处理后在G2期中仍有16.5% FRA3B顺序未被复制，因此脆性位点迟复制DNA对复制抑制剂的进一步抑制效应特别敏感[7]。CFS的特点之一是富含AT二核苷酸的重复序列，从而使DNA扭曲可变性增大[8,9]，大都与染色体DNA缺失相关的肿瘤发生相关[10,11]。

1.2 染色体脆性位点与肿瘤

许多研究已经证明CFS与肿瘤发生的相关性[7,12-17]，在肿瘤中需要逐个研究CFS中缺失的基因，从而探讨CFS与在肿瘤中的作用机制。抑癌基因的研究目前已经成为肿瘤学研究的热点，发现新的抑癌基因并证明其与细胞恶性转化的作用及机制已成为肿瘤发生学的重要内容。在恶性肿瘤中CFS基因出现缺失，提示CFS基因在肿瘤发生发展中可能具有重要的生理功能。FHIT(一种二核苷三磷酸酶)，WWOX(一种氧化还原酶)和其他几种CFS相关基因已被确认为抑癌基因，大多数关于CFS基因的功能研究也集中在FHIT和WWOX，它们的缺失可能导致肿瘤发展[11,18]。研究表明这些基因的缺失和/或表达降低是多种肿瘤预后不良的预测因子，有许多关于基因组改变和癌前病变中蛋白质表达缺失的报道，表明肿瘤抑制作用始于癌症发展的早期阶段[19,20]。FHIT表达的缺失是通过启动子甲基化和/或缺失造成的，这种缺失机制与多种肿瘤的进展和存活率的降低相关[20-22]。WWOX基因纯合子和半合子缺失在多种肿瘤出现，并且在人类的多种肿瘤中都有WWOX灭活，实验证明WWOX缺失的小鼠29%自发生瘤，WWOX缺失加化学致癌物诱导可使动物的发病率高达96%，其中27%具有侵袭性[18,23]。最近，PARK2将它们与培养细胞和小鼠癌症模型中的DNA损伤反应联系起来[11]。据报道，FHIT的缺失导致dNTP失衡和自发复制应激[24]，并且WWOX在ATR介导的DNA损伤检查点应答激活中起关键作用[25]。与这些假设一致，Fhit和Wwox缺陷小鼠都表现出肿瘤发病率增加和对致癌物诱发的肿瘤的易感性的升高[26,27]。在缺失WWOX的肿瘤细胞中异位表达的WWOX可以抑制免疫受损小鼠中的细胞和肿瘤生长，同时缺失WWOX的小鼠中骨肉瘤，肺和乳腺癌的发生率更高[28]。但是FHIT和WWOX在DNA损伤反应中的作用机制并不完全清楚。

CFS发现已有三十多年的历史[1,2,15,29]，但是由于缺少鉴定CFS的方法，CFS的研究出现瓶颈，其生物学功能以及作用机制仍不清楚。近年来，有学者发现在 CFS区域分布着一些microRNA，并且这些microRNA与肿瘤发生和预后有一定的关系[30,31]，但却没有足够的证据其表明是否与染色体脆性位点相关，microRNA与染色体脆性位点的关系及其在肿瘤发生发展中的意义仍有待进一步研究。因此寻找并确定CFS位点新基因并阐明其生物学行为，研究其对肿瘤的调控机制以及临床转化研究具有重要意义，并有可能应用于肿瘤的分子诊断和风险预测。

2 FATS (fragile-site associated tumor suppressor)基因

2.1 FATS基因的发现

用p53杂合子近交系C57BL/6J小鼠建立自发淋巴瘤模型，由于γ-射线辐射显著增加p53缺陷小鼠的致瘤率，对5周龄实验组p53杂合子小鼠实施一次单剂量(4Gy)γ-射线照射，同时建立小鼠诱发淋巴瘤模型[32,33]。6-12个月后，收集并提取小鼠肿瘤的基因组DNA，对照组提取未经照射处理的正常p53杂合子小鼠基因组DNA。利用覆盖95%以上小鼠基因组的BAC微阵列DNA芯片，对32个自发淋巴瘤DNA样品和29个DNA损伤诱发淋巴瘤DNA样品进一步利用微阵列比较基因组杂交Array-CGH(microarray comparative genomic hybridization，Array-CGH)分析，掌握小鼠肿瘤全基因组缺失或扩增图谱，分辨率为200kb。根据普通型脆性位点基因在进化上的保守性，着重分析在DNA损伤诱发淋巴瘤中的染色体缺失区域，结合生物信息学研究，确定在某些高频缺失区域存在一些已知的抑癌基因(例如TCR?， p63等)，证明所获得的小鼠诱发淋巴瘤基因组图谱的可靠性和真实性。我们进一步发现在小鼠第七号染色体末端有一个缺失频率很高的区域(约200kb)，这个区域在小鼠诱发淋巴瘤的缺失频率比在自发淋巴瘤中高6倍，而且DNA序列分析显示在这个对DNA损伤敏感的区域存在一个未被国际同行研究过的新基因我们将其命名为FATS(fragile-site associated tumor suppressor)。对小鼠诱发淋巴瘤第七号染色体的Array-CGH 图谱，箭头所指处的高频缺失区域进一步进行生物信息学研究表明：这一区域在DNA损伤诱发淋巴瘤 (IR+)中的缺失频率为70% (n=29)，但在自发淋巴瘤(IR-)中的缺失频率下降为10% (n=32)。高频缺失区域对应BAC克隆为RP23-35I7。人类FATS基因结构以及在10号染色体脆性位点FRA10F的定位。红色荧光原位杂交信号显示探针BAC克隆RP11-179O22。FRA10F在正常人细胞中的出现频率小于1%[34](图1)。这验证了Array CGH技术应用于DNA损伤诱发小鼠肿瘤模型是发现CFS基因的新途径。

A.利用比较基因组杂交(CGH)技术,对遗传背景一致的p53(+/-)小鼠淋巴瘤进行全基因组扫描分析 B.肿瘤基因组7号染色体基因拷贝数扩增及缺失的代表性图谱。FATS基因位于近端粒区的一个显著缺失位点(箭头所指处) C.FATS基因结构示意图：生物信息学分析结果表明：该基因最大编码外显子区(编码N端363个氨基酸残基)在肿瘤中的缺失频率很高,并且对DNA损伤极其敏感,具有统计学意义(P<0.001,n=29)。IR：离子辐射

图1 FATS新基因的发现

2.2 FATS基因与肿瘤的基础研究

FATS 基因的内含子和表达调控区含有丰富的AT重复序列，具有典型的脆性位点基因特征。FATS是本课题组在国际上首先发现的与DNA损伤诱发肿瘤相关的抑癌基因，定位于10q26.2，荧光原位杂交(FISH)实验证实FATS位于染色体脆性位点FRA10F上[34]。由于多种肿瘤在这一位点出现杂合子丢失(loss of heterozygosity,LOH)，因此FATS基因可能与人类肿瘤的发生有着密切的关系。进一步发现， FATS 基因不仅在乳腺癌、卵巢癌、肺癌患者DNA中存在显著的缺失， RT-PCR检测发现在与相应正常细胞和癌旁组织比较FATS mRNA表达水平在多种癌细胞和肿瘤组织中出现降低甚至不表达，将 FATS 表达载体共转染细胞后，呈现明显的体外(in vitro)和体内(in vivo)抗肿瘤活性[35]。FATS 基因是如何抑制肿瘤发生发展的机制已经取得重要进展，研究发现FATS基因的表达能显著诱导p21的蛋白表达量，p21是调控细胞周期的重要的抑制性因子，从而使细胞周期阻滞于G1期[34]。使用射线或者药物诱导DNA损伤，FATS可以更加有效的使细胞周期阻滞于G1期。在MEF细胞中应用FATS- siRNA抑制FATS 基因表达，同时诱导DNA损伤，发现细胞进入有丝分裂期的比例增高，提示G2/M细胞周期节点(checkpoint)功能受损[34]。应用荧光显微镜，发现在DNA诱导损伤和 抑制FATS 表达后，进入M期的细胞存在严重的胞质分裂缺陷、并影响细胞有丝分裂中着丝粒(centrosome)的正常分布，表明 FATS 基因表达对维持基因组稳定性(genomic stability)有重要影响[35]。

FATS 是一个有重要生物学功能的肿瘤分子标记物，初步研究证实：FATS 通过与组蛋白去乙酰化酶HDAC1发生蛋白质相互作用，抑制HDAC1对p21蛋白的去乙酰化而增加细胞内p21蛋白的稳定性和丰度，对维持基因组稳定性有重要作用[34]。虽然FATS在转录水平受p53抑癌基因的调控，但在p53失活后 FATS 表达仍具有抗肿瘤活性[35]。由于 FATS 基因在DNA损伤诱发的肿瘤中缺失频率增加与p53杂合型缺失的遗传背景有关，而且p53对DNA损伤修复有重要调控作用[36],进一步推测 FATS 对p53的表达可能有影响。为验证这一实验假说，首先将 FATS 表达载体共转染，免疫印迹实验结果显示 FATS 基因表达可显著诱导细胞内p53蛋白的表达水平增高。用小分子RNA抑制 FATS mRNA 的表达，细胞中p53蛋白表达水平随之下降，提示 FATS 基因的表达对于维持p53蛋白表达水平是必需的。这些初步研究结果提示 FATS 和p53这两个抑癌基因之间存在相互调控关系，即：FATS 基因的转录受p53调控[35]， FATS 基因的表达反过来又提高p53的蛋白表达水平[37]。对FATS功能在细胞水平上的基础性研究证实：FATS参与DNA损伤反应和细胞周期调控，FATS蛋白 N-端(67-175)区域直接结合组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)、增强细胞周期负调控因子p21的乙酰化修饰，进而抑制蛋白酶体C8亚单位与p21蛋白C-端的结合和蛋白酶体对p21的直接降解[34]。通过筛选小鼠睾丸cDNA文库，本实验室在国际上首次发现一个FATS mRNA剪接异构体(GenBank 收录号GQ499374)，以此确定FATS启动子区序列,并证实FATS在转录水平受p53激活[35]。最新的研究成果表明FATS蛋白的N端(1-67)区域与p53蛋白发生直接相互作用，FATS表达能增强p53蛋白的表达水平[38]。进一步发现FATS是一个独特的不依赖于泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)的泛素连接酶(ubiquitin ligase,E3)。与以往发现的E3不同，FATS对p53的多聚泛素化修饰并不导致p53降解，相反，FATS增强p53蛋白的转录因子活性和稳定性。体外泛素化实验结果证实：FATS对p53的多聚泛素化修饰并不通过K-48单一泛素链介导，而是由K63-、K11-、和K29-三种泛素链组成[38]，这种多聚泛素链可形成非线性的分枝状结构。我们在国际上首次发现：FATS介导的p53泛素化修饰水平在DNA损伤后伴随着p53的激活而增强，并促进p53在DNA损伤后磷酸化和乙酰化修饰水平的增高[38]。

FATS作为p53的转录靶点，FATS与Mdm2竞争与p53和多聚泛素化p53形成复合物，导致p53功能的稳定和完全激活[38]。FATS还能独立泛素化稳定p21，在DNA损伤后严格控制细胞周期检查点，进一步保证p53-p21通路抑制肿瘤发生的功能。FATS基因位于容易受到DNA损伤的基因组区域，这可能是其在肿瘤基因组中经常缺失和广泛下调的原因。p53的充分激活可能有助于在DNA复制和DNA损伤下积极修复FATS位点的损伤，从而维持FATS基因的表达和功能[34,35,38](图2)。

2.3 FATS基因的临床转化研究

临床转化研究显示 FATS 基因的功能性变异rs11245007(905C>T，262D/N)其病例对照研究发现，CT或TT基因型对妊娠≥3胎的妇女罹患乳腺癌具有保护作用，其不受家族史的影响[39]。更重要的是，最新的 FATS 转化医学研究结果提供了 FATS mRNA 表达异常与乳腺癌和非小细胞肺癌发生的直接证据:在23例配对乳腺癌组织和15例配对肺癌组织中，FATS mRNA 在肿瘤组织中的表达水平与来自同一个体的正常组织相比(表达异常率100%)均有不同程度降低或沉默[37,40]。在对乳腺癌的临床转化研究中我们发现：FATS 高表达比 FATS 低表达患者有更好的预后(P=0.006)，通过多因素分析 FATS 高表达是接受放疗乳腺癌患者的独立预后因素(P=0.012)[37]。进一步，我们通过克隆形成实验，发现高表达 FATS 可增加乳腺癌细胞的放疗敏感性，敲低 FATS 导致乳腺癌细胞放疗抗拒，证实 FATS 的确调控乳腺癌放疗敏感性[37]。接下来应用 FATS 过表达载体 3xFlag-FATS 转染MDA-MB-231细胞，同时用 FATS 干扰质粒 FATS-shRNA 转染MDA-MB-231细胞作为对照，通过6Gy/f的x线照射后，运用流式细胞术观察，结果显示：提高 FATS 表达水平后，其对放疗更加敏感，我们同时检测了凋亡蛋白Cleaved PARP，结果显示：FATS 高表达组Cleaved PARP 明显升高。这些研究结果提示放疗后 FATS 调控了细胞凋亡从而提高放疗敏感性[37]。但是 FATS 调控细胞凋亡的分子机制仍待阐明，我们推测可能与p53蛋白的相互作用相关。在对肺癌的研究中发现：在接受铂类联合化疗的患者中， FATS mRNA高表达较低表达预后更好；而未接受含有铂类化疗的患者，FATS mRNA表达水平则与患者预后无关，这提示FATS高表达与铂类药物化疗敏感性相关[40]。进一步将FATS过表达质粒转染肺癌细胞系H1299和A549，并应用顺铂对细胞进行杀伤，我们发现FATS过表达可以增强顺铂对肺癌细胞的杀伤能力，并增加顺铂诱导的细胞凋亡率[40]。FATS可能通过调节DNA损伤后细胞周期节点调控功能、维持基因组稳定性、并抑制肿瘤细胞中DNA修复异常，从而增强铂类化疗药物的抗肿瘤疗效。

图2 FATS抑癌分子机制示意图

3 研究的意义与展望

近年来，对于脆性位点的研究越来越多，CFS位点基因具有进化上保守、与肿瘤发生发展密不可分、同时可能还参与调控DNA损伤反应信号通路，寻找确定CFS位点基因的新途径、发掘和鉴定新的CFS基因并阐明CFS基因与癌症发生的关系是一个颇具挑战性的前沿课题，最新发现FATS基因极有可能是肿瘤发生早期起关键调控作用的候选分子标志物，并可应用于癌症的分子诊断和风险预测，对研究肿瘤的发生发展具有重要意义，可为预防和治疗肿瘤提供新的策略,但是 FATS 的分子调控机制仍待进一步阐明。