淫羊藿苷对藻酸盐3D体外培养下小鼠软骨细胞周期蛋白、β-catenin表达的影响

王鹏珍，熊喜峰，秦胜男，张金丽，李爱国

广州市红十字会医院 广州市创伤外科研究所，广州510000

损伤关节软骨的重塑和修复，需要足量、有活性的关节软骨细胞[1,2]。关节软骨是无血管和高度特异化的组织，内衬在活动关节表面。软骨层可以降低关节面之间的摩擦，并可以起到缓冲减震、承载压力的作用[3]。值得注意的是，关节软骨一旦发生损伤，其固有的无血管、低细胞密度和低细胞迁移能力的特点都会限制软骨组织的再生。如何获得大量活性高、增殖能力强的软骨细胞，在细胞治疗关节软骨损伤的过程中起关键作用[4,5]。文献报道，适宜浓度的淫羊藿苷(ICA)可以显著促进关节软骨细胞增殖并提高细胞活性[2,6]；我们的前期研究中也发现，ICA在10-6μmol/L 时可以显著促进原代小鼠关节软骨细胞增殖[7]。但是，其具体作用机制尚不清楚。2019年3～12月，我们拟在软骨细胞-藻酸盐3D培养条件下，研究ICA对体外小鼠关节软骨细胞增殖相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin表达的影响，旨在为ICA用于细胞工程治疗骨关节炎提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料 ICA购于北京北奥创新科技有限公司，批号为20090503，经HPLC测定ICA 含量不低于98%；出生2 d的C57BL/6雄性小鼠均购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK-2013-0002，本实验设计及过程均符合本院动物伦理委员会规定。DMEM完全培养基，含10% 小牛血清、100 U/mL青/链霉素、20 mmol/L L-谷氨酰胺；Ⅰ型胶原酶(9001-12-1,Sigma)，D型胶原酶(11088866001,Roche)。抗兔HRP/DAB 免疫试剂盒批号(b64261,Abcama)，兔抗鼠β-catenin(sc-7963,Santa Cruz)，兔抗鼠Cyclin D1 (sc-2978,Santa Cruz)，兔抗鼠Cyclin E(sc-2925, Santa Cruz)；荧光定量PCR试剂盒TB Green Premix ExTaq Ⅱ (RR066A, Takara)，荧光定量PCR仪(qTOWER 2.2，Analytik Jena AG)。

1.2 实验方法

1.2.1 软骨细胞的分离和培养 参考本课题组前期文献的操作方法[7]，取新生2 d的小鼠关节软骨组织；用0.7 mg/mL的Ⅰ型胶原酶消化30 min，移入含0.7 mg/mL Ⅰ型胶原酶和3 mg/mL D型胶原酶的PBS混合液中，37 ℃消化6 h。用直径180 mm的滤膜过滤消化下来的软骨细胞，离心后用PBS洗3次，将细胞重悬在DMEM完全培养基中；在5% CO2、37 ℃条件下培养，每3 d换液1次[8,9]。

1.2.2 藻酸盐3D复合体构建及冰冻切片制作 原代软骨细胞用胰酶消化后，用 2%(w/v)灭菌的藻酸盐溶液重悬细胞，制成1×106/mL 的细胞悬液，吹打均匀；吸取20 μL滴入装有102 mmol/L 无菌CaCl2溶液的6孔板中，藻酸盐与软骨细胞很快凝结成三维复合物；待复合物形状稳定后，小心吸走无菌CaCl2溶液；将复合物分为两组，ICA组和对照组分别加入含10 μmol/L ICA 、不含ICA的DMEM完全培养基，每组设3个复孔；在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养14 d，培养基每3 d更换1次。软骨细胞-藻酸盐3D复合物用PBS洗涤3次后，分为3份样品。其中2份放入 4%多聚甲醛中固定,制作冰冻切片，切片厚度为 4 μmol/L，-80 ℃冰箱保存，用于阿利新蓝组织学染色、免疫组化实验;另外1份样品中加TRIzol裂解，进行RNA提取，用于荧光定量PCR实验。

1.2.3 软骨细胞活性和酸性黏多糖合成情况观察 采用阿利新蓝组织学染色[10]。将冰冻切片从冰箱中取出，复温5 min；用PBS洗涤3次，每次5 min。将切片放入1%阿利新蓝染液中，染色10 min；用PBS洗涤3次，每次5 min。最后进行封片及镜检，依次进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于倒置显微镜下观察拍照。成簇状排列的软骨细胞增多表示软骨细胞活性增加，阿利新蓝染色强度加深表示软骨细胞酸性黏多糖合成增加。

1.2.4 软骨细胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin蛋白检测 采用免疫组化法。将冰冻切片从冰箱中拿取出，复温5 min；PBS洗3次，每次5 min；3% H2O2孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。常温下，血清封闭45 min。用滤纸吸去封闭液，直接滴加兔多克隆抗Cyclin D1(1∶3 000)、Cyclin E(1∶3 000)、β-catenin(1∶3 000)一抗工作液，4 ℃过夜，IgG作为阴性对照。次日，PBS洗3次，每次3 min。HRP标记二抗室温下孵育 30 min。PBS 洗3次，每次3 min。DAB显色5 min，自来水终止反应。PBS洗3次，每次3 min。苏木素复染核30 s，自来水冲洗，封片及镜检。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，用倒置显微镜下观察拍照。在显微镜下，随机选择组织切片的3个视野计数阳性细胞和总细胞，细胞内有目标蛋白表达且呈棕色为阳性细胞[9]。蛋白阳性表达率=阳性细胞/总细胞×100%。

1.2.5 软骨细胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin mRNA检测 采用荧光定量PCR法。用TRIzol试剂盒对样品进行RNA抽提，用Nanodrop 2000分光光度计测定RNA浓度；将PrimeScriptTMMaster Mix试剂盒RNA进行逆转录，合成cDNA。用TB GreenTMPremix Ex TaqTM进行荧光定量分析，反应程序采用两步法。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s；60 ℃退火及延伸 34 s。以β-actin作为内参[10]，用2-△△Ct对mRNA表达进行相对定量分析。目的基因引物序列见表1。

2 结果

2.1 两组软骨细胞活性和酸性黏多糖合成情况 ICA组成簇状排列的软骨细胞明显多于对照组，阿利新蓝染色强度明显深于对照组，并可见大量酸性黏多糖集聚与软骨陷窝及周边，表明ICA增加小鼠关节软骨细胞活性和酸性黏多糖合成。见图1。

图1 两组软骨细胞活性和酸性黏多糖合成情况(阿利新蓝染色)

2.2 两组软骨细胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin蛋白及mRNA表达比较 与对照组比较，其ICA组软骨细胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin蛋白及mRNA表达均增加(P均<0.05)。见表2、图2。

3 讨论

胶原酸性黏多糖的蛋白核心结构上附着硫酸化糖胺聚糖(GAG)，使其形成一个大的高度带负电荷的分子，容易与酸性染料阿利新蓝结合，阿利新蓝染色的深浅可反映软骨细胞酸性黏多糖合成量的多少[11]。本研究结果显示，10 μmol/L的ICA可促进小鼠关节软骨细胞的增殖与活性，并能提高细胞增殖相关蛋白的转录和表达水平。ICA显著增加了小鼠软骨细胞酸性黏多糖的合成与分泌，酸性黏多糖以及Ⅱ型胶原的致密结构又将软骨细胞围在致密的软骨陷窝里，保证软骨细胞代谢的营养供给，从而提高软骨细胞的活性[12]；同时，软骨细胞外基质产生的因子本身也会增强软骨细胞活性。

表2 两组软骨细胞Cyclin D、Cyclin E、 β-catenin的表达情况

注：与对照组比较，*P<0.05。

注：箭头所示为目标蛋白在细胞中的表达部位。

图2两组软骨细胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin蛋白表达情况(免疫组化法)

本研究显示，在藻酸盐3D培养下，ICA促进小鼠关节软骨细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E 蛋白和mRNA的表达。Cyclin D1属于周期蛋白家族成员之一，其功能是调节细胞周期，主要在G1期表达，驱动细胞向S期过渡，从而合成更多的DNA物质，为细胞分裂做准备。有研究表明，用RNA手段干扰大鼠软骨细胞Cyclin D1表达，大鼠软骨细胞细胞分裂停滞在G1期[13,14]。Cyclin E/周期依赖性激酶2(CDK2)复合体是细胞分裂从G1期进入S期重要的调节元件。文献报道，ICA通过上调Cyclin E、CDK2以及下调p21、p27的表达，提高胚胎干细胞的自我更新能力[13]。β-catenin作为一种多功能的蛋白质，主要介导细胞间黏附和参与基因的表达，以此参与成骨细胞和软骨细胞的增殖和分化[16,17]。本研究中，ICA激活了β-catenin的表达，Cyclin D1作为其靶基因和细胞分裂G1/S期的阳性助推器[18,19]，表达水平也显著上调。但是，具体是通过HIF-1α/β-catenin通路激活β-catenin，还是Wnt/β-catenin通路调控β-catenin表达，仍需要进一步深入研究。

本研究发现，小鼠关节软骨细胞中β-catenin与Cyclin D1、Cyclin E均表达增加。究其机制，可能是藻酸盐这种材料使细胞聚集成团，形成内部相对致密三维立体环境[8,20,21]。这种环境与软骨细胞本身所处的软骨外基质非常相似，为小鼠关节软骨细胞提供了一个适宜软骨细胞增殖和代谢的微环境。在这种条件下，ICA通过某种信号通路，激活β-catenin的转录和表达，从而诱发及其下游基因Cyclin D1、Cyclin E的表达。而且，藻酸盐具有软骨结构非常相似的致密立体结构，有利于软骨细胞增殖和细胞之间的信号传递。由此可见，ICA可以通过上调β-catenin、Cyclin D1、Cyclin E表达，提高小鼠关节软骨细胞活性，促进小鼠关节软骨细胞增殖，该结论可为ICA用于细胞工程治疗骨关节炎提供理论基础。