血培养报阳时间对肿瘤患者并发大肠埃希菌血流感染产AmpC酶及死亡的预测价值

张青， 李丁，李峥，白长森，张文芳，郑珊，周云丽

天津医科大学肿瘤医院 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市肿瘤防治重点实验室 天津市恶性肿瘤临床医学研究中心, 天津300060

大肠埃希菌是引起血流感染最常见的革兰阴性杆菌，是医院感染的主要病原菌，医院感染分离率一直居于首位，尤其是肿瘤患者，相较其他病种更易发生血流感染[1，2]。随着抗菌药物广泛应用于临床，特别是广谱β-内酰胺类抗菌药物大量使用，导致越来越多耐药菌株的产生，其中产AmpC酶、β-内酰胺酶大肠埃希菌是耐药菌株的代表之一[3]。近年来，产AmpC酶大肠埃希菌的检出率已从0.1%升至3.8%。由于高产AmpC酶大肠埃希菌具有广泛的耐药性，用药单一，仅对第四代头孢抗生素和碳青酶烯类敏感，对临床治疗和控制医院感染造成极大困难。然而，美国临床实验室标准委员会(CLSI)针对大肠埃希菌只有产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的检测标准，对AmpC酶检测尚无统一的方法；目前，临床实验室通常只能根据耐药表型综合判断推测产AmpC酶细菌，但其假阳性和假阴性较高。Coudron等[4]提出的改良三维试验法以及分子生物学方法等虽然准确可靠，但过程繁琐复杂，所需时间长，只适合实验室研究，难以在临床常规检测中开展。血培养报阳时间(TTP)指从血培养孵育开始到血培养仪报警阳性的时间[5]，是血流感染严重程度的新兴判断指标，成为指导临床诊治血流感染简便快速的一种新手段。但是，TTP与产AmpC酶大肠埃希菌血流感染及其病死率相关性研究尚未见报道。本研究对天津医科大学附属肿瘤医院大肠埃希菌血流感染的肿瘤患者进行回顾性调查，旨在探讨血培养TTP对大肠埃希菌产AmpC酶以及肿瘤患者死亡的预测价值，为临床医生及早选择合适抗生素治疗和提高患者生存率提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经天津医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准，收集2016年1月～2018年12月临床诊断为大肠埃希菌血流感染的成人肿瘤患者。纳入标准：①经病理检查确诊为实体肿瘤或血液肿瘤；②符合卫生部2001年颁发的《医院感染诊断标准》(试行)执行中华人民共和国卫生部[6]血流感染诊断标准；③血培养分离并鉴定为大肠埃希菌株；④年龄>8岁。排除标准：①病例资料不完整；②同一患者检出相同的分离菌株或混合菌感染。共纳入符合标准患者248例，其中男125例、女123例，年龄19～85岁，实体肿瘤232例、血液肿瘤16例，发生肿瘤转移100例，合并高血压63例、心脏病40例、糖尿病38例，行机械通气32例、插管或穿刺115例、肿瘤手术141例，实施放化疗160例，输血69例，累计适当抗生素治疗(AAT)﹤24 h 39例、24～﹤48 h 70例、48～﹤72 h 81例、≥72 h 58例，并发器官衰竭55例、脓毒症26例、休克18例，入住ICU 28例，住院期间死亡48例。

1.2 血培养TTP检测 通过外周静脉无菌穿刺获得血液约20 mL，均匀分配于BACTECTM需氧和厌氧血培养瓶约10 mL，立即送至微生物室。利用美国BD公司生产的BACTEC FX400全自动血培养仪进行35 ℃孵育监测，该系统通过荧光传感器每10 min检测CO2生成量来监测细菌生长，从血培养接种到检测到阳性荧光信号的这段时间即为TTP。当同一组中有多个瓶子呈阳性时，选择最短的TTP进行分析。

1.3 大肠埃希菌产AmpC酶检测 经AmpC酶表型筛选试验的菌株，应用改良三维试验检测[4]。将0.5 Mcf大肠埃希菌ATCC25922菌液涂布于M-H平皿(天津金章科技有限公司)上，取30 μg头孢西丁纸片(北京天和生物技术有限公司)置于平皿中心，使用手术刀片在离纸片边缘3～5 mm处呈放射状由里向外切割一道狭缝；用微量加样器取40 μL受试菌酶粗提取物由里向外加入狭缝内，尽量避免酶液溢出狭缝。将M-H平皿放入35 ℃孵箱过夜。若观察到作为指示菌的ATCC25922沿小槽向心性生长，即为AmpC酶试验阳性。

2 结果

2.1 血培养TTP及大肠埃希菌产AmpC酶检测结果 血培养TTP为(9.42±3.45)h，产AmpC菌株45株(18.1%)。

2.2 血培养TTP预测大肠埃希菌产AmpC酶的价值 产AmpC酶患者TTP为(7.97±1.96)h，短于非产AmpC酶患者的(9.75±3.56)h(P<0.001)。ROC曲线显示，血培养TTP预测大肠埃希菌产AmpC酶的最佳截点为8.16 h，此时的敏感度为72%、特异度为62%、AUC为0.680，见图1。本研究中血培养TTP<8.16 h的产AmpC酶大肠埃希菌有28株，占所有产AmpC酶大肠埃希菌的62%。

图1 血培养TTP预测大肠埃希菌产AmpC酶的ROC曲线

2.3 血培养TTP预测肿瘤并发大肠埃希菌血流感染患者死亡的价值 单因素分析显示，血培养TTP、肿瘤转移、器官衰竭、脓毒症、休克、机械通气和输血是患者住院期间死亡的预测风险因子(P均<0.05)，见表1；多变量回归分析显示，血培养TTP(OR=2.29, 95%CI0.69～8.63,P=0.042)、肿瘤转移(OR=14.61,95%CI3.68～57.99,P<0.001)， 器官衰竭(OR=39.18,95%CI11.10～138.22,P<0.001)、休克(OR=9.44，95%CI1.92～44.76,P=0.005)是患者住院期间死亡的独立危险因素。ROC曲线显示，血培养TTP预测肿瘤并发大肠埃希菌血流感染患者住院期间死亡的最佳截点为9.24 h，此时的敏感度为66%、特异度为75%、AUC为0.692，见图2。

3 讨论

近年来，获得广谱头孢菌素耐药性AmpC酶的大肠埃希菌流行率不断上升。本研究分离的248株大肠埃希菌中产AmpC酶菌株45株，检出率为18%，高于国内外其他文献报道[4，7，8]。这可能由于肿瘤患者长期的肿瘤负荷，机体本身处于免疫低下状态，加之住院期间频繁的侵入性操作容易损害机体免疫屏障，导致肿瘤患者相对其他病种更易发生血流感染，而且也易引起感染菌耐药。因此，寻找能够为临床早期菌血症提供预警信息，并能快速评估多重耐药菌血流感染患者预后的指标，对指导抗感染治疗具有重要意义。

表1 肿瘤患者并发大肠埃希菌血流感染的死亡预测风险因子单因素分析结果(例)

图2 血培养TTP预测肿瘤并发大肠埃希菌血流感染患者住院期间死亡的ROC曲线

已有文献报道，血培养TTP在金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎链球菌所致血流感染中具有较高的预测价值，并表明其可以提供与血流感染有关病原菌的早期线索[9～11]。本研究比较了大肠埃希菌产AmpC酶和非产AmpC酶患者的血培养TTP，结果发现产AmpC患者的TTP短于非产AmpC酶患者；通过绘制ROC曲线显示，TTP≤8.16 h是预测大肠埃希菌产AmpC酶的最佳截点。有文献显示，多重耐药菌生长速率受某些毒力因子表达的影响，另外抗菌药物临床用量的变化或抗菌药物使用频次均可能影响细菌的耐药率[12，13]。例如：对第三代头孢菌素的过度使用是引起细菌产生β内酰胺酶导致耐药的主要原因，我们推测多重耐药菌感染患者体内一些促炎因子表达增高，从而导致血液中细菌大量繁殖。因此，本研究认为较短的血培养TTP可能是预测产AmpC酶的重要指标，可以初步提示临床医生及时选择合适抗生素治疗，以减少产AmpC酶菌株引发耐药，提高治愈率，改善患者的预后。

本研究结果显示，住院期间死亡患者血培养TTP短于生存患者，血培养TTP较短是大肠埃希菌血流感染肿瘤患者住院期间死亡的预测风险因子。这与Bo等[14]和Martinez等[15]研究结果一致，他们认为TTP与严重败血症或休克存在相关性，并发现有严重败血症或休克的死亡患者血液培养中大肠埃希菌生长较快。在本研究中，脓毒症休克、器官衰竭、肿瘤转移均是死亡的预测风险因子。因此，对血培养出现较短TTP的患者，微生物室应考虑向医生及时建议优化抗菌治疗方案和其他可能改善患者预后的处理措施，加强对肿瘤患者的病情监测，尤其要注意肿瘤转移患者术后的并发症；对于长期住院患者和机械通气患者，医护人员应更加重视和警惕，以降低血流感染的发生率，从而降低患者病死率，以提高其生活质量。本研究尚有以下不足之处：第一，本研究是在单中心肿瘤患者中进行，有待于在临床实践中进行大样本的多中心研究。第二，该检测方法不能区分染色体或质粒介导酶，尚需要进一步研究。

综上所述，根据TTP可以初步判断菌株是否产AmpC酶，从而指导临床选择合适抗生素治疗；同时，较短TTP可作为大肠埃希菌血流感染肿瘤患者预测死亡的风险因子，这为临床不易察觉的血流感染肿瘤患者提供了重要的预警信息，可作为快速预测死亡患者并在早期干预中受益的筛选指标。