不同亚硝酸盐对斑马鱼胚胎发育的急性毒性效应

李琳，梁辉，陈俗汝，刘迎佳，王维香

（西华大学食品与生物工程学院,四川 成都 610039）

随生活水平的不断提高，人们更加关注食品卫生质量，愈发注重饮食安全健康。因此，建立食品相关物质的快速毒性评价和致病机理研究平台显得尤为重要。

亚硝酸盐作为良好的防腐剂和发色剂广泛应用于肉制品加工中，然而，有研究发现亚硝酸盐急性中毒易致机体缺氧，容易导致肝脏组织的损伤[1,2]。陈永芳[3]通过建立亚硝酸盐暴露小鼠模型研究了亚硝酸盐对学习记忆的影响，结果表明亚硝酸盐能降低小鼠学习记忆能力，降低程度与亚硝酸盐浓度呈剂量效应。另有实验表明：亚硝酸盐能引起小鼠不孕，或大鼠睾丸毒性[4-6]。斑马鱼Danio rerio 为新兴的模式生物，在毒性研究方面与人类基因有87%的相似基因而具有独特的作用[7]。本实验以斑马鱼为模式生物，通过研究亚硝酸盐的急性毒性，观察亚硝酸盐对斑马鱼胚胎发育的致死、孵化和畸形效应，比较NaNO2和KNO2对斑马鱼胚胎的毒害效应，以期为评估亚硝酸盐的毒性和研究亚硝酸盐对人体的影响提供食品安全评价基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用野生型斑马鱼雌雄成鱼，体形正常，鳞和鳍无损，游动灵活，捕食敏捷。

实验药品为NaNO2、KNO2、NaCl、KCl、NaHCO3、CaCl2、苯氧乙醇、吖啶橙（成都科龙试剂有限公司，分析纯）。

实验用斑马鱼养殖系统（青岛中科海海水处理有限公司），恒温培养箱（CB1350，上海皓庄仪器有限公司），SZX10 型OLYMPUS 显微镜（日本奥林巴斯株式会社OLYMPUS CORPORATION）。

1.2 方法

1.2.1 胚胎培养液配制

分别称取3.500g 的NaCl、0.050g 的KCl、0.025g的NaHCO3、0.100g 的CaCl2溶解于纯净水中，定容至1L 作为胚胎培养液。

1.2.2 处理液的配制

配制8.0 mg/mL NaNO2母液，将母液用胚胎培养液分别稀释成质量浓度为0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL 和2.0 mg/mL 的处理溶液；配制10.0 mg/mL KNO2母液，将母液用胚胎培养液分别稀释成质量浓度为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL 和3.0 mg/mL 的处理溶液。

1.2.3 胚胎收集和处理

成年斑马鱼饲养在置于14 h∶10 h 的明暗交替系统下的3 升养殖水箱中，水箱中装有处于循环系统中脱氯和紫外线消毒的养殖水。养殖水温度保持在26.0～（28.5±1）℃，电导率保持在500～（750±50）s，酸碱度保持在6.9～（7.5±0.5），溶解氧饱和度等于或高于95%。成鱼每天用人工饲料（德国TetraMin）和活的丰年虾喂养2 次，每周6 天。

实验前一天，按2∶1 的比例选取健康的性成熟活泼雄、雌斑马鱼放入盛有养殖水的交配盒中，用隔板隔开，遮光处理。第二天将隔板取走，光刺激，雌雄鱼追逐开始产卵，记录产卵时间。30 min 内将鱼卵挑出、清洗干净至无异物附着，受精后5～6hpf（hours post fertilization）在体式显微镜下观察选择发育正常的胚胎放入盛有5.0 mL 处理液的6 孔板中，每孔30 个胚胎，置于（28.5±0.5）℃的恒温培养箱中暴露至96 hpf。期间，每隔24 h，换新鲜处理液。分别在24 hpf、48 hpf、72 hpf 和96 hpf 时观察记录胚胎死亡、孵化、畸形情况，以及24 hpf 时测定胚胎5 min 内的自主活动次数，48 hpf 时测胚胎20s 内的心跳次数，72 hpf 时测量孵出仔鱼体长。用改良寇式法[8]计算NaNO2和KNO296 hpf 的LC50（导致胚胎死亡50%时的浓度），EC50（导致胚胎致畸50%时的浓度）以及IC50（抑制50%胚胎孵出时的浓度），重复实验3 次，并用Excel 单因素显著差异法统计分析对照组和实验组之间各测定指标结果的差异性（P＜0.05）。

1.2.4 胚胎细胞凋亡荧光染色

96 hpf 时将六孔板中孵出仔鱼用胚胎液洗一次，每孔加入2.5mL 2.0mg/L 吖啶橙染色液，暗处理30min；随后用胚胎培养液清洗三次，每次静置5min；加入1.0mL 0.08%苯氧乙醇，麻醉后置荧光显微镜下观察荧光强度并用Image J 软件分析荧光强度。

2 结果与分析

2.1 不同亚硝酸盐对斑马鱼胚胎孵化率、致畸率和致死率的影响

正常胚胎在48 hpf 时开始孵出，72 hpf 内全部孵出。由图1-A 可知，亚硝酸盐处理组随处理浓度增大，孵化率下降，并呈剂量效应，表明亚硝酸盐对斑马鱼胚胎孵化有抑制作用。用改进寇氏法计算NaNO2和KNO2对斑马鱼胚胎的96 hpf-IC50分别为0.84 mg/mL 和1.04 mg/mL，表明NaNO2对斑马鱼孵化抑制程度强于KNO2。

由图1-B 可见，经NaNO2和KNO2处理后，斑马鱼胚胎均在48 hpf 时开始出现异常，并随浓度增加和作用时间延长，畸形率增加，呈剂量效应，表明亚硝酸盐诱导斑马鱼胚胎发育畸形。NaNO2和KNO2对斑马鱼胚胎的96 hpf-EC50分别为1.12 mg/mL 和1.50 mg/mL，表明NaNO2对斑马鱼胚胎发育的致畸效应强于KNO2。

图1 不同亚硝酸盐对斑马鱼的孵化率（A）、畸形率（B）和死亡率（C，96hpf）的影响Fig.1 Effects of nitrite on hatching rate（A），deformity rate（B）and mortality rate（C,96hpf）of zebrafish

NaNO2和KNO2对斑马鱼胚胎发育的致死率见图1-C。由图1-C 可知：在72hpf 内，各个浓度的NaNO2和KNO2处理液对斑马鱼胚胎并无致死性。在96 hpf 时，0.4 mg/mL 和0.8 mg/mL NaNO2的低浓度处理液的致死率不高，分别为2.23%和4.43%；1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0mg/mL NaNO2处理液的致死率分别为28.00%、41.33%以及81.67%。0.5 mg/mL 和1.0 mg/mL KNO2处理液在低浓度的致死率较低，两者均为4.44%，在1.5 mg/mL 时致死率开始迅速上升，死亡率为8.89%，2.0 mg/mL、3.0 mg/mL处理液的致死率分别为22.22%、53.33%。亚硝酸盐处理导致斑马鱼胚胎死亡且致死率与亚硝酸盐浓度呈剂量效应。NaNO2和KNO2对斑马鱼胚胎的96 hpf-LC50分别为1.30mg/mL 和1.44 mg/mL，表明NaNO2对斑马鱼胚胎发育的致死性大于KNO2。

2.2 不同亚硝酸盐对斑马鱼胚胎自主活动、心率、体长的影响

由图2-A 可知，在不同浓度亚硝酸盐处理液下，斑马鱼自主活动受到抑制。随着处理液浓度的增加，抑制作用也逐渐增强，且在0.5 mg/mL 和1.0mg/mL KNO2时有显著性差异（P＜0.05）。

图2 不同亚硝酸盐对斑马鱼自主活动次数（24hpf）（A）、心率（48hpf）（B）以及体长（72hpf）（C）的影响Fig.2 Effect of nitrite on the number of independent activities（24hpf）（A）、heart-beating rate （48hpf）（B）and body length（72hpf）（C）of zebrafish

由图2-B 可知，48hpf 时空白组的胚胎每20s内心跳45 次，随着NaNO2浓度增大，斑马鱼胚胎心率逐渐降低，2.0mg/mL 时差异显著，各KNO2溶液浓度对斑马鱼心率的影响较小。

由图2-C 可知，在72hpf 时的斑马鱼仔鱼平均体长为3400.00μm。随着NaNO2、KNO2浓度增加体长减小，但两者对斑马鱼仔鱼体长的影响无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 不同亚硝酸盐导致斑马鱼胚胎畸形

显微镜观察发现（图3-B 和3-C），NaNO2和KNO2处理斑马鱼均存在心包水肿、脊柱弯曲、头部卵黄不同程度发黑等畸形现象，且以头部发黑为主，其次是脊柱弯曲，最后是心包水肿，部分胚胎发育迟缓且伴随着一定程度的头部发黑与心包水肿，表明NaNO2和KNO2对斑马鱼的毒害机理相似。96hpf 时，2.0 mg/mL NaNO2处理导致斑马鱼头部发黑、脊柱弯曲、心包水肿的畸形各占比分别为90.00%、87.78%和33.33%，而3.0mg/mL KNO2处理导致畸形各占比分别为50.00%、53.33%和18.89%（图3-D），表明NaNO2对斑马鱼胚胎发育的致畸性更严重。

2.4 亚硝酸盐诱导斑马鱼胚胎细胞死亡

图3 不同亚硝酸盐对斑马鱼胚胎形态发育致畸的影响Fig.3 Effect of nitrite on morphological developmental deformity of zebrafish embryos

图4 NaNO2 处理导致斑马鱼胚胎死亡Fig.4 Effect of NaNO2 on cell death of zebrafish embryos

吖啶橙荧光染色可以反映细胞死亡情况[9]。由图4-A 可知，对照组斑马鱼的头部、卵黄囊有较浅的绿色，说明在正常生长过程中有少许细胞凋亡，且主要集中在头部、卵黄部。随着亚硝酸盐浓度的增加，斑马鱼头部和卵黄荧光色增加，在1.6mg/mL和2.0mg/mL NaNO2下，头部、卵黄部荧光色最明显。随处理液中亚硝酸盐浓度增加，死亡细胞数增多，脊柱也出现不同程度的荧光色，表明脊柱已受到毒害作用，且毒害作用与NaNO2浓度呈剂量效应。用Image J 软件进行荧光强度分析显示（图4-B），NaNO2浓度在1.6mg/mL 和2.0mg/mL 时差异显著（P＜0.05）。

3 讨论

斑马鱼是研究脊椎动物发育的理想模型。其易发生基因突变，体表形态上会有明显的变化，这为研究基因组、蛋白质组学提供了很好的实验材料。在毒理学研究和污染控制中，它用于各类标准化的化学品和排放物的急、慢性毒性试验[10]。亚硝酸盐在肉制品、腌制品等中普遍应用，研究亚硝酸盐对人体、动物、环境的毒害作用有重要意义。

本研究发现，亚硝酸盐对斑马鱼生长的毒害主要表现为自主活动和心跳次数减少、体长变短、心包水肿、脊柱弯曲、卵黄异常、头部发黑等，这与Simmons 等[11]的研究结果一致，同时与龙虎斑（Epinephelus lanceolatus×E.fuscoguttatus）、大刺鳅Mastacembelus aculeatus 幼鱼的中毒症状相似。两者暴露在亚硝酸盐环境中均体色加深、鳃丝呈棕色、鱼体失去平衡侧躺，最终死亡[12,13]。NaNO2暴露能降低斑马鱼心跳次数，说明其对斑马鱼的心脏发育有一定毒害作用。李俊博等[14]研究发现，亚硝酸盐以浓度依赖的方式致斑马鱼瓣膜发育的毒性效应，胚胎心脏水肿等发育异常,其作用的时间自36hpf 起。从48hpf 开始，过量的亚硝酸盐影响房室通道处的心内膜垫发生,导致在76hpf 时斑马鱼的瓣膜发育明显缺失。实验测得72hpf 时亚硝酸盐处理的斑马鱼仔鱼体长短于对照组，表明亚硝酸盐抑制斑马鱼生长。Vosláová 等[15]采用OECD 215 幼鱼生长试验，通过亚致死剂量研究NO2-对斑马鱼生长的影响，其结果表明，NO2-抑制斑马鱼幼鱼生长。

本研究用改良寇氏法计算得NaNO2对斑马鱼胚胎的96hpf-LC50为1.30mg/mL，KNO2的96hpf-LC50为1.44 mg/mL，而Simmons 等[11]研究得到96hpf-LC50为0.41 g/mL。Petra 等[16]测得NO2-对斑马鱼96hpf-LC50为0.24mg/mL。本研究的LC50明显高于已报道文献，原因可能是受毒时间不同，Simmons等[11]的实验受毒时间是24h 开始，胚胎越早接触处理液，可能会产生抵抗性，敏感性会降低。曹伏君等[12]和樊海平等[13]分别对龙虎斑、大刺鳅幼鱼进行了亚硝酸盐急性毒性作用的研究。结果表明亚硝酸盐对龙虎斑和大刺鳅幼鱼的96hLC50分别为90.41mg/L 和0.789mg/L。与斑马鱼相比，龙虎斑和大刺鳅幼鱼比较敏感，容易受到亚硝酸盐的毒害。童雅琛等[17]发现，低浓度（2.0mol/L）的亚硝酸盐会造成家兔心率加快，高浓度（5.0 mol/L 和7.0 mol/L）下，心率出现明显下降。大鼠经1.0mL 的2%或4%的NaNO2溶液投服后，即可引起中毒死亡[18]。Til等[19]研究大鼠接受不同浓度KNO2的饮用水的毒性作用，观察到剂量相关的肾上腺带状肾小球肥大，对大鼠的无作用剂量低于100 mg/L。根据世界卫生组织《饮用水水质准则》，对于奶瓶喂养的婴儿，其接触亚硝酸盐主要的外部来源就是饮用水，以婴儿免得高铁血红蛋白症的亚硝酸盐准则值为3.0mg/L（以NO2-计）[20]。尚未见有关于KNO2对斑马鱼的毒害作用的报道，本研究丰富了相关资料,具有一定借鉴意义。亚硝酸盐对斑马鱼胚胎及幼鱼的毒性特征与传统动物模型的毒性特征相似，且毒性实验简单易操作，斑马鱼可以替代传统动物模型用于食品安全检测。