禽畜抗生素维吉尼亚霉素研究进展

仝倩倩，李亚亮，王顺昌，颜守保

(1.淮南师范学院生物工程学院，安徽 淮南 232038；2.资源与环境生物技术安徽普通高校重点实验室，安徽 淮南 232038)

0 引言

1955年[1]，De Somer及Van Dijck从比利时土壤中分离并纯化获得一株“899”号菌株，即维吉尼亚霉素(virginiamycin，VGM)产生菌维吉尼亚链霉菌(Streptomycesvirginiae).该药物抗菌谱较窄，主要抗革兰氏阳性菌，如八叠球菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等，目前尚未发现耐药菌.VGM在动物肠道内不易被吸收，毒性小，被广泛用于预防及治疗猪下痢和鸡坏死性肠炎等疾病，并能针对性地杀死动物肠道内有害的革兰氏阳性菌，缓解肠道蠕动，从而提升饲料利用率，是业界公认的安全无毒畜禽抗生素[2，3].

1 结构特点

VGM是由两种成分(M及S因子)自然组合的链阳性菌素，M1为大环内酯，S1为环状多肽，其中M∶S质量比约为(70%～80%)∶(20%～30%).M1分子式：C28H35N3O7；S1分子式：C43H49N7O10.其结构式如图1所示.

M与S两因子同时存在时，协同作用强，特别是当M∶S约为7∶3时，杀菌效果最好.但M或S因子单独存在时，仅表现出抑菌作用.如，M因子单独抑制金黄色葡萄球菌时的最小抑菌浓度为0.25 μg/mL，S因子单独抑制藤黄微球菌时为4 μg/mL；二者共同存在时仅为0.125 μg/mL.

2 理化性质及在售产品

作为一种非晶态褐黄色粉末，VGM有着特殊的臭味，低水溶性(563 μg/mL)，易溶于甲醇、乙醚及氯仿等多种有机溶剂.由于VGM在碱性溶液中及紫外光下会很快失活，因此VGM保存时需要避光、干燥[4].

VGM通常作为饲料预混剂出售，其载体多为碳酸钙、大豆粉、米糠、玉米粉及黄豆饼粉等.目前商用预混剂的浓度各不相同，包括Stafac®1 000、500、50、20及2.2%等几种剂型，即每kg含1 000、500、50、20及2.2 gVGM.低浓度的预混剂能够促进饲料吸收，增加家禽体重.中、高浓度的可以用于控制并治疗猪下痢及鸡坏死性肠炎.

3 安全性及作用

VGM由M及S因子构成，目前还未报道有耐药菌株，VGM对人类健康的风险是可以忽略的[5].欧盟动物营养科学委员会[6](Scientific Committee on Animal Nutrition，SCAN)认为，动物使用VGM不会引发耐药性，动物微生物不会转移到人消化道微生物，从而危害人类药物的使用；大环内酯类耐药性不会在饲养动物之间转移；也不会从动物传递给人类.Acar[7]等认为没有严格的证据证明动物中使用VGM会在人类中产生抗性菌，进而导致临床感染.

VGM可用作动物的生长剂，只需添加微量的VGM就能呈现较好的促生长及提高动物饲料利用率的作用.Gadde[8]等在研究VGM对肉鸡生长性能时发现，在鸡膳食中补充20 g/t的维吉尼亚霉素，0 d～21 d肉鸡的体重增加了10.1%(p<0.05).此外，VGM主要抑制肠道内的革兰氏阳性菌，但它不能通过革兰氏阴性菌的细胞膜，所以对革兰氏阴性菌几乎没有影响[9].VGM能够减少了产气荚膜梭菌的肠道定植，并降低了由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎的严重性和死亡率[10].另外，VGM还可有效降低动物肝脓肿的发病率[11].

4 发酵生产工艺

4.1 菌种选育

微生物是发酵工业的灵魂，因此，微生物菌种选育工作一直是研究人员关注的首要问题.

目前，VGM产生菌主要有两种：维吉尼亚链霉菌(S.virginiae)[12]及灰绿链霉菌(S.griseoviridus)[13].生产VGM的出发菌株为S.virginiaeATCC 13161，它是美国辉宝公司经过几十年的时间，通过比较S.virginiae孢子产生能力、基内菌丝、气生菌丝及VGM产量，从数百万株链霉菌中通过各种物理化学诱变育种方法结合各种抗性筛选手段分离筛选出来的[14].

1994年李向前[13]，通过紫外照射及亚硝基胍处理S.griseoviridus400E-2菌株后，获得一株稳定高产株S.griseoviridusLR-0940，经过发酵条件优化后，其生物效价是原菌株30的倍.2007年陈睦等[15]从北京郊区采集的土壤样品中分离纯化出一株产VGM的菌株Streptomycessp.X-435，紫外诱变后出现三种菌落形态，最终确定正突变株为草帽型菌落，并进一步筛选获得一株稳定突变株F5-25-U-28，其效价高于出发菌株将近20倍.2018年周跃慧[16]等借助物理诱变与链霉素抗性筛选相结合的方法选育维吉尼亚霉素高产突变株，结果显示微波诱变效果较好，正突变率高达32.83%；并获得一株高产菌株MW 178(146.72 ±11.80 μg/mL)，较出发菌株(21.24±1.34 μg/mL)提高了约6倍.同年，笔者[12]借助基因组重排结合硫酸链霉素筛选技术，经过5轮基因组重排，成功获得一株VGM高产突变株G5-103，产量为251 mg/L.

4.2 发酵原料

发酵原料包括碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等，对产物的代谢影响很大.张兆利等[17]在专利中公开了一种以StreptomycesvirginiaeMAFF 10-06014为菌种，生物合成VGM的廉价培养基，其中氮源包括黄豆饼粉、玉米浆、豆粕等，浓度为2%～10%；碳源包括淀粉、蔗糖、葡萄糖等，浓度为4%～8%；硫酸盐包括硫酸锰、硫酸亚铁等，浓度为0.000 5%～0.005%；另外还有0.1%～1.0%的碳酸钙，调节初始pH为4.0～8.0之间.在该条件下，VGM中M因子的产量在1 g/L以上，最高达1.5 g/L.韩风华[2]在专利中公开了一种维吉尼亚链霉菌ACCC40768合成VGM的方法，包括斜面、种子和发酵培养基具体成分及培养条件，并在发酵前期12 h～24 h加入乙酸钠和丙酸钠作为前体，在此条件下，VGM最大产量为3 500 μg/mL.任勇[18]在专利中公开了一种维吉尼亚链霉菌合成VGM的种子、发酵培养基，并同时公开了了发酵过程中的补料方法，包括补油、补水、补糖等.

4.3 代谢调控

不同菌株和培养条件对VGM的产量和生物量影响显著.在链霉菌的发酵中，有一些自动调节剂(包括A-因子，Gräfe因子，virginiae butanolides，inducing material等)，可以以nM级别的浓度(10 nmg/L～100 nmg/L)，诱导次级代谢产物的产生.如virginiae butanolides能够在纳克每毫升浓度下诱导维吉尼亚链霉菌合成VGM[19].

Yang[20]等经研究发现，VGM的生产属于非生长偶联型，遂通过两步优化法来提高VGM的产量.具体地，通过研究培养基最佳成分及浓度，延长维吉尼亚链霉菌生长期，从而获得较高浓度生物量；此外，在发酵过程中添加了自动调节剂virginiae butanolides-C，用于提高VGM的产量.Shioya[21]等研究了搅拌速度对VGM产量的影响，发现提高转速对依赖于溶解氧(DO)的抗生素生产有促进作用.以低于450 rpm的速度开始培养维吉尼亚链霉菌，直至DO达到80%，然后调节搅拌转速，使DO维持在80%，并且加入自动调节剂virginiae butanolides-C，最终产量可达到399 mg/L，是未调整前的1.8倍.

Dzhavakhiy等[22]利用之前研究中获得的一株突变株S.virginiaeVKM AC-2738D，将其从摇瓶培养扩大至中试规模(100 L)的发酵罐中培养，并评价了合成吸附树脂原位分离发酵液中VGM的可能性.发现，在优化pH、溶解氧情况下，连续添加蔗糖对VKM AC-2738D进行分批补料发酵，最终VGM产量达到4.9 g/L.在测试的4种树脂中，Diaion®HP21吸收了98.5%的VGM，进一步简化了提取程序，最终VGM总量达5.6 g/L.

周跃慧[16]等在利用微波诱变获得的一株突变株MW178进行发酵时，在初始阶段加入适当浓度的氯化镧，发现VGM产量得到显著提高，从146.72 μg/mL提高至180.01 μg/mL，提高了22.69%，表明在发酵初始阶段，加入适当浓度的稀土元素镧有利于VGM的积累.

5 小结

VGM是一种窄谱、高效安全的新型抗生素，具有良好的环境及社会效益.虽然国内外有VGM的生产报道，但市场基本被美国辉宝公司占领，国内并无VGM的生产报道.虽然VGM的发现较早，但仍存在很多问题.用传统诱变育种方法进行VGM菌种选育虽已有很多报道，并取得了一定的进展，但抗生素整体效价仍较低，今后可引入一些新颖的诱变育种技术，如常压室温等离子体诱变、离子束诱变、基因工程育种等技术提高维吉尼亚链霉菌的基因突变频率，并结合代谢调控手段，获得稳定经济的突变株.其次，未来需要更加深入地探索和研究不同的发酵原料对VGM产量的影响，并适当开发一些传统原料以外的新原料，拓宽其原料种类.另外，研发者可着手考察发酵过程中泡沫、CO2、补料等因素对VGM发酵的影响.最后，优化VGM发酵液下游分离纯化工艺也是以后的研究方向之一.随着研究的深入，VGM对畜牧业的发展将会发挥更重要的作用.