STIP1基因沉默对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响

朱 鹏，刘 琮，李 博，赵 晨，周 涛，周鹏飞，张 兵

(西安医学院第二附属医院骨外科，西安 710038)

骨肉瘤是青少年最常见的原发性骨肿瘤。骨肉瘤常发生在长骨的表面，常见于股骨远端胫骨近端和肱骨[1]。现在骨肉瘤患者5年生存率接近70%[2]。但仍有部分骨肉瘤患者发生远端转移，常见为肺转移，有证据[3]表明发生肺转移的患者5年生存率只有23%～44%。因此，寻找合适的骨肉瘤早期诊断的标志物和有效治疗的靶分子是进一步提高骨肉瘤患者生存率至关重要的一步。

磷酸化应激诱导蛋白1(stress-induced phosphoprotein 1，STIP1)能够通过调节Hsp70和Hsp90连接及二聚化参与调控细胞的多个生理过程。近年来研究[4-5]证明STIP1在乳腺癌和胃癌中表达上调，然而STIP1在骨肉瘤中的表现尚未见报道。本研究发现STIP1在骨肉瘤细胞中表达上调，通过STIP1基因沉默(si-STIP1)，可抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，为STIP1在骨肉瘤诊断与治疗中的应用提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人成骨细胞hFOB1.19、骨肉瘤细胞系U2OS、MG-63和SaoS-2购自上海中科院细胞库；DMEM培养基购自和胎牛血清购自美国HyClone公司；Lipofectamine 2000和TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自美国Promega公司；SBYR Green Mix购自德国Qiagen公司；si-STIP1及其阴性对照(si-NC)购自上海GenePharma公司；细胞裂解液和CCK-8细胞活性测定试剂盒购自上海Beyotime公司；Transwell培养板购于美国Corning公司；STIP1抗体、MMP2抗体、MMP9抗体、p-IGF1R抗体、IGF1R抗体、p-PI3K抗体、PI3K抗体、p-AKT抗体和AKT抗体购自美国Abcam公司；β-actin抗体和GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化酶标记的二抗购自北京ZSGB-BIO公司；ECL试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组

人成骨细胞和骨肉瘤细胞培养在含10%胎牛血清以及1%青霉素/链霉素的DMEM中，置于5% CO2、37 ℃的培养箱中，每2 d传代1次。U2OS细胞分为2组：si-NC组(细胞转染si-NC 48 h)和si-STIP1组(细胞转染si-STIP1 48 h)。

1.2.2 实时定量PCR

按照TRIzol试剂说明书提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定各组样品的RNA浓度。按照说明书将5 μg总RNA逆转录为cDNA。各组设置3个复孔，使用ABI 7700荧光定量PCR仪器测定目的基因的表达。STIP1和β-actin引物序列由上海Sangon Biotech公司合成。PCR程序设置：预热94 ℃ 2 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。β-actin作为内参，采用2-△△Ct计算STIP1的基因表达水平。

1.2.3 CCK-8实验

U2OS细胞接种于96孔板中，待细胞融合度达到60%～70%，采用lipofectamine2000将si-NC和si-STIP1转至细胞。48 h后，弃上清，各孔加入110 μL培养基(含10 μL CCK-8反应液)，于37 ℃反应2.5 h。采用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度值。

1.2.4 Transwell实验

U2OS细胞的迁移和侵袭采用Transwell方法测定，铺有基质胶的小室用于测定细胞侵袭能力，无基质胶的用于检测细胞迁移能力，每组设置3个复孔。各组细胞经转染si-NC和si-STIP1 48 h后，取细胞悬液接种于24孔板的上室中，下室中加入600 μL完全培养基，在37 ℃孵育24 h。用镊子取出小室，4%甲醛溶液固定10 min，0.1%结晶紫染色15 min。各组随机取5个视野在倒置显微镜下对迁移的细胞数目进行计数。

1.2.5 蛋白印迹

当转染48 h后，弃培养基，并采用PBS清洗细胞3次，加入细胞裂解液，于冰上反应15 min，收集细胞，12 000 r·min-1离心15 min，取上清液。各组蛋白的浓度采用BCA试剂盒测定。配置SDS-PAGE胶，各孔按照50 μg上样量进行加样，然后电泳、转膜。将膜置于5% BSA室温封闭1 h，4 ℃过夜孵育STIP1、MMP2、MMP9、p-IGF1R、p-PI3K、p-AKT、IGF1R、PI3K、AKT、GAPDH和β-actin一抗。室温孵育辣根过氧化酶标记的二抗1 h，采用ECL方法显色。采用ImageJ计算各条带的光密度值。

1.3 统计学方法

所有试验至少重复3次，数据均以均数±标准差表示，SPSS 11.0软件包用于分析数据。2组间比较采用SNK检验，多组间比较采用ANVOA分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 STIP1在骨肉瘤细胞中的表达

实时定量PCR和蛋白印迹法测定结果显示，在hFOB1.19、U2OS、MG63及SaoS-2细胞中STIP1基因表达水平分别为(1.02±0.03)、(4.26±0.46)、(3.15±0.32)和(3.86±0.36)，蛋白表达水平分别为(1.01±0.02)、(2.93±0.29)、(2.54±0.31)和(3.09±0.34)，与hFOB1.19细胞相比，其他细胞STIP1基因与蛋白相对表达水平均显著上调(P<0.05)，见图1。

2.2 沉默STIP1抑制骨肉瘤细胞增殖

U2OS细胞转染si-NC和si-STIP1后，实时定量PCR测定结果显示，si-NC组和si-STIP1组STIP1基因表达水平分别为(0.98±0.03)和(0.34±0.09)，与si-NC组相比，si-STIP1组STIP1基因表达水平显著下调(P<0.05)，见图2A。此外，CCK-8实验结果显示，与si-NC组相比，si-STIP1组U2OS细胞增殖活性显著降低(P<0.05)，见图2B。这些结果表明STIP1基因沉默抑制U2OS细胞增殖。

2.3 沉默STIP1抑制U2OS细胞的侵袭和迁移

将si-NC和si-STIP1转染至U2OS细胞中，Transwell方法检测结果显示，si-STIP1组与si-NC组U2OS细胞迁移率分别为(54.29±7.59)%、(102.35±5.56)%，侵袭率分别为(61.29±6.94)%、(96.68±4.19)%，与si-NC组相比，si-STIP1组U2OS细胞迁移率、侵袭率均显著降低(P<0.05)，图3A—B。此外，蛋白印迹法测定结果显示，si-NC组和si-STIP1组U2OS细胞MMP2、MMP9蛋白表达水平分别为：(1.02±0.03)和(0.43±0.06)、(0.99±0.03)和(0.67±0.09)，与si-NC组相比，si-STIP1组MMP2、MMP9蛋白表达水平均显著下调(P<0.05)，图3C—D。实验结果表明沉默STIP1抑制U2OS细胞的迁移和侵袭。

A：细胞迁移率；B：细胞侵袭率；C：MMP2蛋白表达水平；D：MMP9蛋白表达水平。*P<0.05与si-NC组比较。

图3 沉默STIP1抑制U2OS细胞的侵袭和迁移

2.4 沉默STIP1抑制IGF1R/PI3K/AKT信号通路激活

IGF1R/PI3K/AKT信号通路参与调控细胞多种生物活性，本研究通过测定IGF1R、PI3K和AKT磷酸化水平考察STIP1调控U2OS细胞迁移和侵袭的可能机制，结果显示，si-NC组和si-STIP1组U2OS细胞IGF1R、PI3K和AKT磷酸化蛋白表达水平分别为：(1.02±0.04)和(0.51±0.08)、(0.98±0.02)和(0.60±0.06)、(1.06±0.04)和(0.43±0.09)，与si-NC组相比，si-STIP1组p-IGF1R、p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平均显著下调(P<0.05)，见图4。表明沉默STIP1抑制IGF1R/PI3K/AKT信号通路的激活。

3 讨论

骨肉瘤是一种常见的原发性恶性骨肿瘤，目前临床采用手术联合辅助化疗能够提高患者的生存率。但是也有部分患者因为耐药性或者肺转移无法从中获益。因此，寻找合适的靶分子用于骨肉瘤早期诊断以及后期治疗中具有重要的临床意义。

目前许多研究证实STIP1在胃癌中表达上调，并促进癌症的发生发展[6]。卿海辉等[7]证实STIP1在恶性骨肿瘤中表达上调。本文也证明STIP1在骨肉瘤细胞中表达上调，提示STIP1参与骨肉瘤的发生发展。

癌细胞的扩散和转移是造成恶性肿瘤患者死亡的主要原因[8]。基质金属蛋白酶(MMPs)包括MMP2与MMP9与肿瘤的发展呈现高相关性，它们不仅能够降解细胞外基质，还能够调节多种细胞功能，包括细胞生长、凋亡，血管生成、侵袭和转移。下调MMP2诱导胶质瘤细胞凋亡[9]。抑制MMP2和MMP9降低视网膜母细胞瘤的迁移及血管生成能力[10]。以往的研究[11-12]证实，STIP1不仅能够作为癌症的潜在标志物，还能够正向调控肝癌以及肾癌细胞生长和迁移[13-14]。本文也证实沉默STIP1抑制骨肉瘤细胞的生长和转移，以及MMP2和MMP9蛋白表达水平。这些结果提示STIP1能够正向调控癌细胞的生长、侵袭和迁移。

IGF-1R是一种受体酪氨酸激酶，在正常人体组织中广泛表达。越来越多的证据表明，IGF-1R与人类肿瘤的进展有关。目前，有学者发现IGF1R在骨肉瘤组织中表达显著升高，抑制IGF1R阻碍骨肉瘤细胞的侵袭和迁移[15]。此外，抑制PI3K/AKT信号通路激活阻碍骨肉瘤的发展[16]。近期，有研究[17]证实过表达STIP1激活PI3K/AKT信号通路。本文发现STIP1缺失抑制IGF1R/PI3K/AKT信号通路的激活，提示IGF1R/PI3K/AKT信号通路可能参与STIP1对骨肉瘤细胞生长和迁移的调控过程。

综上所述，STIP1在骨肉瘤细胞中高表达，沉默STIP1显著抑制骨肉瘤细胞的生长、侵袭和迁移能力，下调MMP2和MMP9的蛋白表达水平。此外，STIP1缺失抑制IGF1R/PI3K/AKT信号通路的激活，提示IGF1R/PI3K/AKT信号通路可能参与STIP1调控骨肉瘤细胞生长和迁移的过程。本研究结果表明STIP1作为一个新颖的诊断和治疗骨肉瘤的标志物和靶点将成为可能。