miR-148a-3p靶向DLL4基因影响婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖和凋亡

李海燕 李凡

婴幼儿血管瘤（Infant hemangioma，IH）是一类以血管内皮细胞增殖为特征的胚胎性良性肿瘤，约占先天性皮肤血管病变的80%，多见于早产儿和低出生体重儿[1]。虽然是一种良性肿瘤，但由于多生长于面部，往往影响患者身心健康，严重时也会导致面部畸形，甚至危及生命[2]。然而，目前缺乏理想的治疗方法。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类约为22个核苷酸的非编码RNA，其通过与靶mRNA 特异性结合抑制翻译或促进降解参与细胞增殖、凋亡等多种过程，是肿瘤的潜在治疗靶点[3-4]。miR-148a-3p是近年发现的抑癌基因，非小细胞肺癌组织中miR-148a-3p 表达降低，过表达miR-148a-3p 可降低癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[5]。过表达miR-148a-3p 还可抑制食管癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[6]。生物信息学分析显示，（Delta-like ligand 4，DLL4）是miR-148a-3p 的潜在靶基因。DLL4 已被证实在DLL4 在增生期IH 组织中高表达并促进IH 内皮细胞的增殖[7]。然而，miR-148a-3p是否靶向DLL4 参与IH 进展尚未可知。本研究以DLL4 为切入点，探讨miR-148a-3p 对IH内皮细胞增殖和凋亡的影响及其潜在机制，以期为IH 临床治疗提供有效靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

收集2016年1月至2019年3月于本院确诊的120例增殖期IH 组织标本。其中男孩52例，女孩68例，年龄中位数为7个月。所有样本均经我院病理科分析证实。所有患者及家属均已签署知情同意书，并获得我院伦理委员会批准。

M199 培养液购于上海钰博生物；SYBR Green Master Mix 购于大连Takara公司；miR-148a-3p 模拟物、抑制物、DLL4 过表达质粒及其相应对照由上海生工公司提供；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、膜联蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天公司；兔源DLL4 抗体、细胞周期素D1（CyclinD1）抗体、P21 抗体、B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体、Bcl相关X 蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）抗体、磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体，山羊抗兔IgG 二抗购于上海赛信通公司。

1.2 细胞培养

参照侯团结等[8]的方法分离血管瘤内皮细胞。采用M199 培养液于37℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱中培养血管瘤内皮细胞，每隔1 天换液一次，30 d 后长成单层细胞，铺满瓶底后进行消化和传代。

1.3 RT-qPCR 检测

TRIzol试剂提取血管瘤组织、正常皮肤组织、各组细胞总RNA，逆转录为cDNA，利用SYBR Green Master Mix试剂配制PCR反应体系，2-ΔΔCt法分析miR-148a-3p（内参为U6）、DLL4mRNA（内参为GAPDH）表达水平。

1.4 细胞转染

接种血管瘤内皮细胞至96 孔板，当细胞汇合度达到80%时，利用lipofectamine 2000 分别转染miR-148a-3p mimics、miR-NC、si-NC、si-DLL4、miR-148a-3p mimics+pcDNA、miR-148a-3p mimics+pcDNA-DLL4至血管瘤内皮细胞，转染48 h 检测转染效果后进行下一步实验。

1.5 MTT 法检测细胞活力

取3×103个细胞接种到96 孔板，24、48、72 h 时每孔加入20 μL 的MTT试剂，37℃孵育4 h 后，吸出培养基，每孔加入150 μL 的二甲基亚砜，震荡溶解后酶标仪检测490 nm 处各孔的吸光度值。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，并悬浮于100 μL 的1×结合缓冲液中。分别加入5 μL 的Annexin V-FITC、PI 染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Western blot 检测蛋白表达

提取细胞蛋白后进行蛋白定量。取适量蛋白样品，按照聚丙烯酰胺凝胶；转膜；膜的封闭；一抗孵育；二抗孵育；化学发光显色；灰度值分析步骤进行。

1.8 双荧光素酶报告实验

含有miR-148a-3p 结合位点序列或突变序列的的3′-UTR-DLL4 的的野生型或突变型（WT 或MUT-DLL4）荧光素酶报告载体由上海吉玛制药技术有限公司提供。WT/MUT-DLL4 分别与miR-148a-3p mimics 或miR-NC 转染血管瘤内皮细胞，48 h 时检测各组细胞荧光素酶活性。

1.9 统计学分析

采用SPSS 20.0 进行数据统计分析。计数资料用n表示，计量资料用（）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-148a-3p和DLL4 在血管瘤组织中的表达

血管瘤组织中miR-148a-3p 的表达较正常皮肤组织降低，DLL4mRNA和DLL4 蛋白的表达较正常组织增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1和表1。

2.2 miR-148a-3p 过表达对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响

与miR-NC组比较，miR-148a-3p 组血管瘤内皮细胞miR-148a-3p 表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。过表达miR-148a-3p 后血管瘤内皮细胞24～72 h 细胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达显著降低，凋亡率、p21和Bax 蛋白表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 抑制DLL4表达对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响

表1 miR-148a-3p和DLL4 在血管瘤组织中的表达（±s）Table1 Expression of miR-148a-3p and DLL4 in hemangioma tissue（±s）

表1 miR-148a-3p和DLL4 在血管瘤组织中的表达（±s）Table1 Expression of miR-148a-3p and DLL4 in hemangioma tissue（±s）

分组正常皮肤组织组血管瘤组织组t值P值n 120 120--miR-148a 3p 1.00±0.07 0.52±0.05 61.125 0.000 DLL4 mRNA 1.00±0.08 3.25±0.31 76.986 0.000 DLL4蛋白0.21±0.02 0.59±0.05 77.299 0.000

与si-NC组比较，si-DLL4组血管瘤内皮细胞DLL4 蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。抑制DLL4表达后血管瘤内皮细胞24～72 h细胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达显著降低，凋亡率、p21和Bax 蛋白表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 miR-148a-3p 过表达对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响（±s）Table2 Effects of overexpressing miR-148a-3p on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cells（±s）

表2 miR-148a-3p 过表达对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响（±s）Table2 Effects of overexpressing miR-148a-3p on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cells（±s）

分组miR-NC组miR-148a-3p 组t值P值miR-148a-3p 1.00±0.08 2.93±0.28 19.883 0.000 OD值（490 nm）24 h 0.37±0.03 0.32±0.03 3.536 0.003 48 h 0.72±0.07 0.43±0.04 10.791 0.000 72 h 1.12±0.09 0.62±0.06 13.868 0.000凋亡率（%）8.36±0.83 22.14±2.21 17.512 0.000 CyclinD1蛋白0.68±0.06 0.22±0.02 21.820 0.000 p21蛋白0.18±0.02 0.57±0.05 21.726 0.000 Bcl-2蛋白0.77±0.07 0.30±0.03 18.514 0.000 Bax蛋白0.27±0.03 0.62±0.06 15.652 0.000

表3 抑制DLL4表达对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响（±s）Table3 Effect of inhibiting DLL4 on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cells（±s）

表3 抑制DLL4表达对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响（±s）Table3 Effect of inhibiting DLL4 on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cells（±s）

分组si-NC组si-DLL4组t值P值DLL4 蛋白0.63±0.06 0.25±0.03 16.994 0.000 OD值（490 nm）24 h 0.39±0.03 0.37±0.03 1.414 0.176 48 h 0.75±0.07 0.51±0.05 8.370 0.000 72 h 1.14±0.09 0.69±0.06 12.481 0.000凋亡率（%）7.56±0.71 19.47±1.56 20.846 0.000 CyclinD1蛋白0.69±0.06 0.28±0.03 18.336 0.000 p21 蛋白0.19±0.02 0.54±0.05 19.498 0.000 Bcl-2蛋白0.79±0.07 0.36±0.03 16.939 0.000 Bax 蛋白0.24±0.03 0.60±0.06 16.100 0.000

2.4 miR-148a-3p靶向调控DLL4 的表达

TargetScan在线预测显示，miR-148a-3p 与DLL4 的3′-UTR 区域存在互补核苷酸序列，见图2。双荧光素酶报告实验显示，与转染miR-NC 比较，转染miR-148a-3p mimics 可降低WT-DLL4 的荧光素酶活性，差异有统计学意义（P＜0.05），而对MUT-DLL4 的荧光素酶活性无显著影响，见表4。Western blot 检测显示，miR-148a-3p 组血管瘤内皮细胞DLL4 蛋白表达较miR-NC组降低；anti-miR-148a-3p 组血管瘤内皮细胞DLL4 蛋白表达较antimiR-NC组升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5和图3。

表4 双荧光素酶报告实验（±s）Table4 Double luciferase report experiments（±s）

表4 双荧光素酶报告实验（±s）Table4 Double luciferase report experiments（±s）

分组miR-NC组miR-148a-3p 组t值P值WT-DLL4 1.02±0.06 0.49±0.04 22.049 0.000 MUT-DLL4 1.04±0.08 1.01±0.07 0.847 0.410

2.5 DLL4 过表达逆转miR-148a-3p 对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的作用

与miR-NC组比较，miR-148a-3p 组血管瘤内皮细胞24～72 h 细胞活力、DLL4、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达显著降低，凋亡率、p21和Bax 蛋白表达增加；与miR-148a-3p+pcDNA组比较，miR-148a-3p+pcDNA-DLL4组血管瘤内皮细胞24～72 h 细胞活力、DLL4、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达显著增加，凋亡率、p21和Bax 蛋白表达降低（P＜0.05）。见表6。

表5 miR-148a-3p 调控DLL4 蛋白的表达（±s）Table5 miR-148a-3p regulates DLL4 protein expression（±s）

表5 miR-148a-3p 调控DLL4 蛋白的表达（±s）Table5 miR-148a-3p regulates DLL4 protein expression（±s）

注：与miR-NC组比较，aP＜0.05；与anti-miR-NC组比较，bP＜0.05

分组miR-NC组miR-148a-3p 组anti-miR-NC组anti-miR-148a-3p 组F值P值DLL4 蛋白0.60±0.06 0.25±0.02a 0.58±0.05 0.87±0.08b 179.814 0.000

3 讨论

近年来多项研究揭示了miRNA 在血管瘤进展中的重要作用。例如，miR-424 的表观遗传沉默可促进血管瘤内皮细胞生长，抑制细胞凋亡[9]。上调miR-206 可降低血管瘤内皮细胞的增殖和侵袭能力，增加细胞凋亡[10]。下调miR-130a 可显著抑制血管瘤的生长和血管生成[11]。本研究发现IH 组织中miR-148a-3p 表达低于正常皮肤组织，于是推测miR-148a-3p 表达异常与IH 进展有关。功能获得实验显示，miR-148a-3p 的恢复可显著抑制血管瘤内皮细胞的增殖并诱导凋亡。进一步分析细胞增殖和凋亡调控因子表达发现，过表达miR-143 显著诱导p21和Bax 的表达，并降低CyclinD1和Bcl-2表达。p21 蛋白是一种内源性细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDK）抑制剂，其通过抑制cyclin/CDK 复合物的活性阻止G1/S 相变[12]。Bax和Bcl-2 细胞凋亡的关键调控因子，Bax 表达增加和Bcl-2表达降低可促进线粒体膜孔的开放，促进细胞色素c 的释放，促进线粒体介导的细胞凋亡。与本研究结论类似，miR-148a-3p在宫颈癌[13]、食管癌[14]、口腔癌[15]中亦呈低表达，上调其表达可抑制肿瘤的恶性进展。以上结果表明，miR-148a-3p 在IH 生长中起抑制作用。

表6 DLL4 过表达逆转了miR-148a-3p 对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的作用（±s）Table6 Overexpressing DLL4 reverses the effects of miR-148a-3p on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cell（±s）

表6 DLL4 过表达逆转了miR-148a-3p 对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的作用（±s）Table6 Overexpressing DLL4 reverses the effects of miR-148a-3p on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cell（±s）

注：与miR-NC组比较，aP＜0.05；与miR-148a-3p+pcDNA组比较，bP＜0.05。

分组miR-NC组miR-148a-3p 组miR-148a-3p+pcDNA组miR-148a-3p+pcDNA-DLL4组F值P值DLL4蛋白0.62±0.06 0.24±0.03a 0.23±0.03 0.53±0.05b 181.823 0.000 OD值（490 nm）24 h 0.38±0.03 0.31±0.03a 0.30±0.03 0.37±0.03b 16.667 0.000 48 h 0.73±0.07 0.44±0.04a 0.41±0.03 0.64±0.05b 87.394 0.000 72 h 1.13±0.09 0.65±0.06a 0.60±0.05 0.98±0.08b 114.990 0.000凋亡率（%）6.59±0.63 21.45±2.18a 23.64±2.33 11.05±1.18b 201.212 0.000 CyclinD1蛋白0.67±0.06 0.23±0.02a 0.22±0.02 0.56±0.05b 275.130 0.000 p21 蛋白0.17±0.02 0.58±0.05a 0.59±0.06 0.28±0.03b 220.054 0.000 Bcl-2蛋白0.78±0.07 0.31±0.03a 0.29±0.03 0.67±0.06b 217.718 0.000 Bax 蛋白0.26±0.03 0.64±0.06a 0.66±0.06 0.37±0.03b 157.967 0.000

为了更深入地了解miR-148a-3p 抑制IH 内皮细胞生长的机制，本研究通过生物信息学预测发现DLL4是miR-148a-3p的潜在靶基因。DLL4是Notch 受体的配体之一，其主要表达与内皮细胞，在调节肿瘤血管生成中起着关键作用。研究显示DLL4 促进肾细胞癌生长、侵袭及血管生成进而促进肿瘤的血行转移[16]。沉默DLL4 可抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡[17]。本研究发现IH 组织中DLL4表达增加，与前人[7]研究结果吻合。功能缺失实验显示，抑制DLL4 抑制血管瘤内皮细胞的增殖并诱导凋亡，诱导p21和Bax 的表达，抑制CyclinD1和Bcl-2表达。同时本研究发现DLL4是miR-148a-3p 的靶基因，过表达miR-148a-3p 可抑制DLL4表达，而抑制miR-148a-3p 则促进DLL4表达。此外，恢复实验显示过表达DLL4 可减弱miR-148a-3p 介导的血管瘤内皮细胞增殖抑制和凋亡促进作用。表明miR-148a-3p靶向DLL4是其抑制IH 生长的重要机制。

总之，本研究表明血管瘤组织中miR-148a-3p表达下调，过表达miR-148a-3p 通过靶向DLL4 抑制血管瘤内皮细胞增殖和诱导凋亡，这一发现为IH 的治疗提供了潜在靶点。