长链非编码RNA HOXA末端转录本反义RNA对胰腺癌诊断的临床价值
2020-06-24陈艳红孙丽刘艳张双双祖蓓蓓牛国平
陈艳红 孙丽 刘艳 张双双 祖蓓蓓 牛国平
江苏省徐州市中心医院检验科,徐州 221009
长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类不编码蛋白质的RNA分子,长度在200个核苷酸以上,具有在人体内参与细胞的发育、成熟、增殖、分化和凋亡等多种生物学功能[1]。HOXA末端转录本反义RNA(HOXA distal transcript antisense RNA, HOTTIP)是从HOXA家族中转录出来的一种lncRNA,参与多种疾病的生物学调控过程[2]。研究表明,HOTTIP与多种恶性肿瘤的发生发展相关[3-4],在胰腺癌中也有异常表达[5],但目前尚未明确血浆HOTTIP对胰腺癌的诊断价值。本研究分析HOTTIP在胰腺癌患者癌组织及血浆中表达的意义,探讨HOTTIP对胰腺癌诊断的临床价值。
资料与方法
一、一般资料
回顾性分析2017年6月至2018年12月间徐州市中心医院18例行手术切除并经病理证实的胰腺癌组织和对应的癌旁正常胰腺组织(距癌病灶>1 cm),其中男性患者12例,女性6例,平均年龄62岁。收集78例临床确诊的胰腺癌患者血浆,其中男性53例,女性25例,平均年龄61岁;收集78例健康体检者作为健康对照组,其中男性50例,女性28例,平均年龄57岁;收集原发性肝癌、结直肠癌、胃癌患者各50例作为疾病对照组。所有患者及健康体检者均未接受放疗、化疗及免疫治疗,且无其他基础病史。本研究经徐州市中心医院伦理委员会批准,所有患者或家属签署知情同意书。
胰腺癌组织及癌旁组织在离体15 min内收集,组织剪碎后用胶原酶消化,置液氮保存待用。各组患者入院2 h内静脉采血5 ml,EDTA-K2抗凝,立即4℃ 500×g离心10 min,然后4℃ 12 000×g继续离心10 min,分离上层血浆,置-80℃保存待用。
二、胰腺癌组织HOTTIP及各组患者血浆HOTTIP、CA19-9水平检测
取液氮保存的组织标本及-80℃保存的待检血浆,加入Trizol裂解,按照总RNA提取试剂盒(美国Applied BioSystems公司)说明书提取总RNA,使用PCR试剂盒(大连宝生物工程公司)分别进行cDNA反转录和目的片段的扩增,以β-actin为内参。HOTTIP正向引物序列为5′-CACACTCACATTCGCACACT-3',反向引物序列为5′-TCCAGAACTAAGCCAGCCATA-3′。PCR反应条件:95℃ 1 min,95℃ 10 s、62℃ 30 s、72℃ 20 s,40个循环。通过仪器自带软件获取Ct值,采用2-ΔΔCt公式计算HOTTIP表达量。
采用电化学发光法(德国Roche Cobas e602)检测胰腺癌患者血浆CA19-9水平。
三、随访
所有患者术后均进行5年随访,随访方式为复诊及电话回访。术后1~2年每1个月进行1次随访,术后3~5年每3个月进行1次回访。总生存期为随访开始至最后一次回访或患者死亡时间。
四、统计学处理
结 果
一、胰腺癌组织及各组患者血浆HOTTIP水平的比较
胰腺癌患者癌组织HOTTIP表达量显著高于相应癌旁正常胰腺组织(2.24±0.25比0.62±0.11,t=6.86,P<0.001);胰腺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌患者及健康对照者血浆HOTTIP水平分别为1.33±0.32、0.57±0.17、0.51±0.10、0.41±0.09、0.54±0.05,胰腺癌组显著高于其他各组,差异均有统计学意义(t值分别为4.58、7.13、8.66、7.25,P值分别<0.05、<0.001、<0.001、<0.001),但肝癌、结直肠癌、胃癌患者血浆HOTTIP水平与健康对照组的差异均无统计学意义(t值分别为0.59、0.26、0.37,P值分别为0.55、0.79、0.52),提示HOTTIP对肝癌、结直肠癌、胃癌患者无诊断价值。
二、胰腺癌患者血浆HOTTIP与CA19-9水平及癌组织HOTTIP表达的相关性分析
胰腺癌患者血浆HOTTIP表达水平为1.33±0.32,CA19-9水平为(659.8±425.9)U/ml,两者的表达呈正相关(r=0.43,P<0.001,图1A);胰腺癌患者血浆HOTTIP水平与胰腺癌组织HOTTIP表达量也呈正相关(r=0.58,P<0.001,图1 B)。
注:HOTTIP为HOXA末端转录本反义RNA;CA19-9为糖链抗原19-9图1 胰腺癌患者血浆HOTTIP与CA19-9(1A)及癌组织HOTTIP(1B)的相关性分析
三、胰腺癌患者血浆HOTTIP水平与临床病理特征、生存率的关系
根据血浆HOTTIP水平的中位数将78例胰腺癌患者分为HOTTIP高表达组和低表达组,各39例。胰腺癌患者血浆HOTTIP水平与TNM分期明显相关,而与患者性别、年龄及淋巴结转移、肿瘤大小无相关性(表1)。Kaplan-Meier生存曲线显示,HOTTIP高表达组胰腺癌患者的生存率明显低于低表达组(15.9个月比30.6个月,χ2=4.36,P=0.035,图2)。
四、胰腺癌患者血浆HOTTIP水平对胰腺癌的诊断效能
胰腺癌患者血浆HOTTIP诊断胰腺癌的AUC值为0.81(95%CI0.74~0.87),约登指数为0.56,诊断临界值为1.14,诊断灵敏度为62%(48/78),特异度为94%(73/78),准确性为74%(58/78)。CA19-9诊断胰腺癌的AUC值为0.72(0.63~0.80),约登指数为0.49,灵敏度为65%(51/78),特异度为84%(66/78),准确性为71%。二者联合诊断的灵敏度为81%(6/78),特异度为97%(76/78),准确性为84%(66/78),提示联合检测HOTTIP和CA19-9能提高诊断胰腺癌的灵敏度、特异度及准确性(图3)。
讨 论
lncRNA在细胞分化、免疫应答、肿瘤细胞浸润甚至转移以及耐药等方面均发挥不同的作用[6]。HOTTIP最初由Wang等[7]发现于人末梢组织成纤维细胞,位于7号染色体短臂1区。HOTTIP不仅可作为分子信号调控细胞增殖、分化,还可作为分子引导,特异性连接并募集混合系白血病复合体/WD重复蛋白5复合物,激活HOXA基因并转录,进而在肿瘤的发生发展中起重要作用。
表1 胰腺癌患者血浆HOPPIT表达与临床病理特征关系(例)
临床病理特征例数HOPPIT表达低高χ2值P值性别5.1650.360 男532924 女251015年龄0.2190.590 <60岁261511 ≥60岁5224 28淋巴结转移3.0920.070 N0351520 N1291316 N214113TNM分期11.2650.029 Ⅰ期271611 Ⅱ期352114 Ⅲ期16214肿瘤大小(cm)3.8060.754 <2.0451332 ≥2.0331320
注:HOPPIT 为HOXA 末端转录本反义RNA
注:HOTTIP为HOXA末端转录本反义RNA图2 胰腺癌患者血浆HOPPIT水平与生存率的关系
注:HOTTIP为HOXA末端转录本反义RNA;CA19-9为糖链接原19-9图3 胰腺癌患者血浆HOTTIP及CA19-9诊断胰腺癌的ROC曲线
本研究结果显示,胰腺癌组织中HOTTIP的表达明显上调,同时胰腺癌患者血浆中HOTTIP水平较健康对照者及肝癌、结直肠癌、胃癌患者明显升高,差异均有统计学意义,而肝癌、结直肠癌、胃癌患者血浆HOTTIP水平与健康对照者的差异无统计学意义,说明HOTTIP诊断胰腺癌具有较高的特异性。本研究结果还显示,胰腺癌患者血浆HOTTIP与CA19-9水平呈正相关。联合应用血浆HOTTIP和CA19-9诊断胰腺癌可以将灵敏度从62%提高到81%,特异度从94%提高到97%,表明血浆HOTTIP有望成为临床诊断胰腺癌的有潜能的肿瘤标志物。
本研究也存在样本选择偏倚、仅限于横断面的研究等不足之处,仍需多中心、大样本进一步证实HOTTIP在胰腺癌中的作用机制及对胰腺癌诊断的临床价值。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突