BMP9介导多种干细胞成骨分化的研究进展

龙国赓，程娇，蒋练

(1.遵义医科大学研究生院，贵州 遵义 563000； 2.遵义医科大学附属口腔医院颌面外科，贵州 遵义 563000)

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员，在骨骼发育、骨形成和干细胞分化中发挥着重要作用[1]。目前已鉴定出20多种BMPs，影响着整个人体的组织结构[2-3]。BMP9因其强大的成骨能力在近年来逐渐被关注。间充质干细胞(mesenchymal sterm cells，MSCs)是具有自我更新能力的多功能干细胞，在干细胞生物学和再生医学领域被广泛关注。成骨细胞MSCs的分化是一个严格调控的序列事件，包括骨和骨骼发育过程中发生的大多数分子过程，而成骨分化由许多途径调节[4-5]。MSCs在再生医学、组织修复及其他细胞疗法中的临床应用越来越受到关注，已从各种来源中分离出MSCs，如骨髓、脂肪组织、脐带组织、牙周韧带、滑膜、经血和牙髓等[6-10]。尽管骨髓是最早发现的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的来源，但BMSCs的使用受到一些因素(如侵入性手术和随后出现的患者不适)的限制。因此，骨髓以外MSCs的来源已被积极探索，且有必要定义关键通路的具体机制以及不同信号通路之间的相互作用。现就BMP9介导多种干细胞成骨分化作用的研究进展予以综述。

1 BMP9经典信号通路对干细胞成骨分化的作用

1.1Smad通路 哺乳动物BMP受体包括7种Ⅰ类受体[激活素受体样激酶(acticin receptor like kinase，ALK)1～7]和激活素Ve型Ⅱ受体[包括激活素受体ⅡA、激活素受体ⅡB、BMP受体Ⅱ、TGF-β受体Ⅱ和抗苗勒管激素受体Ⅱ]，当BMP与Ⅱ型受体结合时，BMP信号被激活，Ⅰ型受体被磷酸化，从而激活受体活化型Smad(R-Smad)蛋白；在细胞质中，R-Smad与共同通路型Smad(co-Smad)结合，并转移到细胞核中以调节靶基因的表达[11-12]。BMP/Smad是介导BMP9成骨活性的经典信号通路[13]。BMP介导的信号转导与特异性细胞表面受体激酶结合后，磷酸化的转录因子Smad1/5/8与核内Smad4形成异二聚体复合物，激活靶基因的转录，有研究证明，与其他成骨BMP一样，BMP9能促进Smad1/5/8的激活[14]。此外，Smad的激活是BMP9介导的小鼠胚胎来源的MSCs(C3H10T1/2)成骨分化所必需的，在BMP9处理的C3H10T1/2细胞中，磷酸化Smad1/5/8的水平同时升高，表明BMP9确实激活了Smad通路；相反，RNA干扰被用来沉默Smad4，减少了Smad1/5/8的核易位，破坏了BMP9诱导的成骨分化，阻止了C3H10T1/2细胞向成骨分化[15]。此外，RNA干扰剔除了Smad4，可抑制BMP9诱导的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性和钙沉积，提示Smad信号在BMP9诱导的MSCs成骨分化中起重要作用[16]。

1.2促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路 MAPK是调节基因表达、有丝分裂、代谢、运动、存活、凋亡及分化的关键蛋白激酶。在哺乳动物中已鉴定出4个以上的MAPK亚家族，包括胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)1/2、ERK5、c-Jun氨基端激酶和p38 MAPK[17]。BMP9诱导成骨分化的机制受到越来越多的关注，除经典的BMPs信号通路外，一些非经典途径及其他通路也受到越来越多的关注，其中MAPK通路研究最多[18]。p38 MAPK通路是MAPK信号通路中的一条经典途径。BMP9可以激活MAPK(p38和ERK1/2)信号通路，但p38和ERK1/2调控BMP9诱导的MSCs成骨分化的作用相反，即抑制p38可降低BMP9诱导的成骨分化，而抑制ERK1/2可刺激BMP9诱导的成骨分化[19]。蒋琳等[20]的研究表明，与BMP2和BMP7相比，BMP9诱导牙周膜干细胞成骨分化的作用更强。张奕等[21]的研究表明，BMP9对人牙周膜干细胞具有诱导成骨分化的能力；同时，p38 MAPK通路在参与该过程的基础上，对BMP9-人牙周膜干细胞成骨分化也具有正向调节作用，为牙周组织再生成骨分化调控提供了理论基础。但该实验为体外实验，更深入的体内调控机制尚需进一步研究。牙周组织再生是近年来研究的热点与难点，其中最关键的是牙槽骨再生[22]。牙周组织再生中首先要解决种子细胞的问题，具有高度增殖、自我更新能力和多向分化潜能的牙周膜干细胞已成为牙周组织再生最理想的种子细胞[23]。

1.3Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路 典型的Wnt信号通路由β-catenin介导，Wnts是一类在骨骼发育和成骨细胞分化中起关键作用的分泌蛋白[24]。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的中心靶蛋白，是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成部分，Wnt/β-catenin信号通路对于正常的骨的形成和发育至关重要[25]。BMP9可诱导BMSCs的成骨分化，当Wnt/β-catenin信号被抑制时，其成骨分化能力显著降低；另外，BMP9信号与Wnt信号途径存在广泛的交叉作用[26]。He等[27]研究表明，高磷能够激活Wnt/β-catenin通路，而BMP9在血管平滑肌细胞中也表现出同样的激活作用，因此，Wnt/β-catenin通路可能在一定程度上介导BMP9诱导的血管平滑肌细胞钙化。Zhang等[28]研究发现，BMP9和Wnt3a可能协同诱导小鼠的牙尖干细胞形成异位骨。这些结果均提示，β-catenin信号通路可能在BMP9诱导的成骨/牙源性信号转导中起重要作用，BMP9和Wnt3a可能协同诱导牙尖干细胞向成骨/成牙本质细胞分化，这可能与β-catenin信号转导功能有关。因此，BMP9和(或)Wnt3a有望成为牙源性再生和牙齿工程新的、有效的重要生物因子。在骨折修复的早期阶段，β-catenin是多能间充质细胞分化为成骨细胞或软骨细胞的必要条件，而在修复后期，β-catenin则是骨祖细胞分化为成骨细胞的必要条件[29]。正在开发的抗硬皮病蛋白抗体等治疗方法，不仅可以促进骨形成，而且有望扭转由于骨质疏松造成的有害骨丢失[30-31]。

1.4Notch通路 哺乳动物有4种Notch受体(Notch1～4)和5种Notch配体(Delta-like 1，3，4、Jagged1和Jagged2)。Notch信号通过相邻细胞Notch配体与受体的相互作用产生，Notch蛋白经过3次剪切，由胞内段(notch intracellular domain，NICD)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL(CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合称)结合，形成NICD/CSL转录激活复合体[32]。文献表明，Notch信号在成骨分化中的作用是矛盾的，但其在调节BMP诱导的MSCs成骨分化中起关键作用[33]。Wang等[34]的研究表明，Notch和BMP通路之间存在着直接的调节关系，原癌基因JunB可能是这两条通路之间的汇合点。JunB可能是一个新的靶点，通过激活Notch信号抑制BMP/Smad信号诱导的MSCs成骨分化。已有研究表明，JunB是骨发育的必需基因[35-36]。由于成骨分化通常与成脂过程有关，因此在体外和体内均检测到了相关的成脂指标[37]。这些结果表明，NICD不仅抑制了MSCs的成骨分化，还抑制了MSCs的成脂过程。组织学染色显示，NICD对骨基质、脂滴和软骨基质的形成有显著的抑制作用，提示NICD不仅可抑制MSCs的成骨分化，还可抑制MSCs的成脂和软骨分化[38]。这一结果表明C3H10T1/2多能干细胞向脂肪细胞的分化需要非经典BMP信号通路[39]。另外，Notch信号通路具有促进细胞增殖和维持MSCs自我更新的能力。这一结果说明了NICD对BMP9诱导成骨分化的负面影响。Yan等[40]研究发现，ALK2的表达在Notch上调后显著增加，当Notch下调时，ALK2的表达降低，但其他BMP受体则无变化；经重组腺病毒显性负性突变型受体ALK2处理后，BMP9诱导的MSCs成骨分化明显受到抑制，但这种抑制作用被Notch配体Ad-DLL1(adenovirus-delta-like 1)抑制，表明Notch对BMP9/Smad信号转导的影响可能是通过上调MSCs中的ALK2来介导的。

2 BMP9与其他途径协同对干细胞成骨分化的作用

2.1胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)信号通路 IGF-1/IGF-1受体信号是IGF家族的主要信号转导途径。配体激活IGF-1受体可导致磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和Raf/ERK两条主要的信号通路激活，调节细胞的生长、增殖和分化[41]。Jiang等[42]的研究表明，IGF-1可以部分逆转地塞米松对BMP9诱导的成骨抑制作用。IGF-1可能通过PI3K/Akt途径上调环加氧酶(cyclooxygenase，COX)-2的表达，从而发挥逆转作用，但确切机制还有待进一步研究。IGF-1在预防骨质疏松方面的研究，为寻找新型抗骨质疏松药物提供了新的方向。Chen等[43]利用重组腺病毒发现，IGF-1增强了BMP9在C3H10T1/2细胞中诱导的ALP活性和基质矿化；体内实验显示，BMP9联合IGF-1治疗组的骨体积和成熟度均大于单独治疗组。IGF-1可以增强骨髓基质细胞中BMP9诱导的BMP/Smad信号的激活，说明IGF-1是BMP9诱导的MSCs成骨分化的一个很好的候选增强剂，这可能是通过促进BMP9启动BMP/Smad信号转导的激活介导的。

2.2Akt通路 PI3K是一类催化肌醇与磷脂酰肌醇的脂质激酶，根据其结构特性分为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类，研究最为广泛的是Ⅰ类PI3K。某些信号因子激活Ⅰ类PI3K，产生细胞内重要的第二信使磷脂酰肌醇 4，5-二磷酸和磷脂酰肌醇 3，4，5-三磷酸，再与Akt结合，促进级联反应继续传递[44]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，处于PI3K/Akt途径的中心环节。Chen等[45]已经证明，在小鼠间充质基质细胞中BMP9介导的成骨细胞分化需要PI3K介导。基质细胞衍生因子1(stroma cell derived factor 1，SDF-1)在干细胞/祖细胞(如MSCs)向损伤部位生长的过程中起重要作用，研究发现，牙周膜成纤维细胞分泌SDF-1，而BMP9能促进人MSCs分泌SDF-1[46-47]。Furue等[48]的实验表明，PI3K特异性抑制剂LY294002不仅可抑制BMP9增强的ALP活性，而且可抑制BMP反应基因和成骨标记基因的表达；此外，LY294002还抑制了BMP9上调的SDF-1的产生。由此认为，BMP9通过PI3K/Akt途径促进牙周膜成纤维细胞的成骨分化和SDF-1的产生。

3 BMP9成骨调控因子对干细胞成骨分化的作用

3.1缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1 HIF-1是骨骼发育等多种发育过程中血管生成的调节因子。Hu等[49]研究了HIF-1α介导的血管生成信号对BMP9调控的MSCs成骨分化的影响，发现BMP9通过Smad1/5/8信号通路直接诱导MSCs中HIF-1α的表达，外源性HIF-1α的表达与BMP9诱导的MSCs成骨分化有协同作用；相反，小干扰RNA介导的HIF-1α沉默或HIF-1α抑制剂对BMP9诱导的MSCs成骨信号有显著的抑制作用。在骨骼系统发育过程中，缺氧和HIF-1驱动的信号参与软骨内骨形成[50]。Drouin等[51]采用定量聚合酶链反应研究了几种成骨性BMP(BMP2、BMP7和BMP9)在常氧孵育或缺氧培养24 h细胞中肌间质细胞(muscle resident stromal cells，MRSCs)的表达情况，结果发现，缺氧和常氧孵育条件下细胞中BMP2和BMP7信使RNA的表达水平相似，缺氧可显著促进BMP9信使RNA的表达；蛋白质印迹法分析显示，在正常培养条件下培养的MRSCs中未检测到BMP9蛋白，而缺氧培养24 h后，在MRSCs中检测到BMP9，5 d后检测到较高水平BMP9，说明缺氧可诱导MRSCs产生内源性BMP9。氧参与许多生理和病理过程，通过促进MRSCs的激活和增殖，以增加MRSCs成骨的能力。这种作用可能通过激活Smad通路以及促进MRSCs表达BMP9来实现，为缺氧异位骨化的研究提供了理论基础，但具体机制还有待进一步研究。

3.2COX COX是一种将花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶。COX的3个转录变异体分别为COX-1、COX-2和COX-3，其中只有COX-2在骨代谢中起重要作用，包括骨再生和骨折愈合，COX-2可促进BMSCs的成骨谱系，并上调成骨标志物；此外，COX-2的表达减少或沉默会延迟骨折愈合[52]。Wang等[53]研究发现，使用含不同浓度COX-2特异性抑制剂NS-398处理细胞，可显著降低BMP9诱导的ALP活性，且呈浓度依赖性；进一步分析发现，BMP9处理组Runx2和DLx-5(distal-less homeobox gene 5)的表达均显著增加，但与COX-2基因剔除结合后表达减弱；然而，Runx2和DLx-5的表达减弱被外源性COX-2表达所逆转，同时，BMP9上调的Smad6和Smad7信使RNA的表达在COX-2被剔除时也受到抑制。这些证据支持COX-2能调控BMP/Smad信号转导，但具体机制尚不清楚，COX-2可能与BMP9形成调节环，调控BMP9启动的BMP/Smad信号转导及BMP9的表达。He等[27]利用COX-2和BMP9存在阳性环的表达设计实验，结果显示，COX-2可能通过部分激活Wnt/β-catenin通路促进BMP9诱导的血管平滑肌细胞钙化，为血管钙化的防治提供了新的靶点。

3.3局灶黏附激酶(focal adhesion kinase，FAK) FAK又称蛋白酪氨酸激酶2，是一种酪氨酸激酶，在整合素介导的信号转导途径中起重要作用[54]。人体脂肪组织含有一种可能分化为多个谱系的细胞亚型，这种细胞被称为脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)[55]。ADSCs与MSCs相似，在适当刺激下可发挥成骨分化作用，促进骨再生，因此研究 ADSCs的成骨调控具有重要意义。Yuan等[56]的研究显示，BMP9处理的ADSCs含有更强的FAK磷酸化和成骨基因表达，当细胞接受较高剂量的BMP9时，ALP、骨桥蛋白、Runx、FAK的强度均会增加；BMP9诱导的ALP和磷酸化FAK信号表明BMP9与ADSC成骨作用具有很强的相关性，而BMP9的作用也增强了FAK的激活，该研究通过Wnt信号通路揭示了FAK-BMP的相互作用，表明FAK可以作为BMP9的下游因子。Zheng等[57]研究发现，BMP9能促进体外滑膜MSCs的增殖、迁移和成骨分化，而小干扰RNA诱导的FAK基因剔除可显著逆转BMP9细胞增殖、迁移和成骨分化，FAK基因剔除能有效抑制BMP9诱导的骨形成，其机制可能与激活Wnt和MAPK途径有关。这些发现为成骨分化和ADSCs、滑膜MSCs的研究，特别是骨再生的研究提供了有力的支持，具有巨大的治疗潜力。

3.4血红素加氧酶(heme oxygenase，Hmox)1 Hmox是一种广泛存在于人类和哺乳动物中的微粒体酶。Hmox以3种同工酶形式存在，即Hmox1、Hmox2和Hmox3。Hmox1在骨折修复过程中可增强MSCs的成骨细胞分化[58]，提示Hmox1在骨发育和成骨分化中发挥作用。另一方面，Hmox1也可能调节脂肪代谢，如Hmox1上调可减轻喂食高果糖饮食小鼠脂肪细胞的功能障碍和肥胖[59]。BMP9诱导的BMSCs向成骨和成脂的分化是相互排斥的[60]。因此，解读Hmox1、BMP9作用下诱导MSCs向成骨/成脂分化的调控机制可能有助于了解骨骼疾病(如骨质疏松症)和脂肪疾病(如肥胖)。尽管Hmox1在成骨中的确切作用尚存在争议，但Hmox1可能在脂肪生成中发挥抑制作用[61-62]。Liu等[63]发现，BMP9能促进β-catenin蛋白总量增加，且在Hmox1处理后β-catenin蛋白水平进一步增加。这些结果提示β-catenin可能是BMP9诱导MSCs Hmox1相关成骨分化和成脂分化的关键调节因子。Hmox1可能通过调节p38、ERK1/2、Akt、Wnt/β-catenin等多种信号通路，增强BMP9诱导的成骨分化，并减弱BMP9诱导的脂肪分化。

4 小 结

BMP9不仅在骨发育和修复再生中起关键作用，而且参与调节胚胎发育和器官发生，并调节各种组织细胞的生长、发育、凋亡、迁移和侵袭等。BMP9介导了多种MSCs成骨分化的作用。虽然目前对BMP9介导的部分信号通路的作用仍存在争议，但随着相关实验研究的不断深入，一定会进一步明确其作用机制，而在这个过程中可能会涉及新的转换平衡。阐明BMP9介导的成骨机制并使其转化到临床应用中，有助于开发更好的治疗方法。深入了解BMP9介导下成骨信号通路与MSCs之间的成骨机制，可能为临床运用多种干细胞治疗相关疾病提供新的思路。