水中铜绿假单胞菌的能力验证关键点控制

谭慧林 金永生 吴忠红

摘 要：通过参加水中铜绿假单胞菌能力验证，提高实验室检验能力，总结实验过程中的关键点控制，讨论应用国家标准GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》检验铜绿假单胞菌存在的问题。

关键词：铜绿简单胞菌;国家标准;检验;关键点

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的条件致病菌，水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道都有此菌存在。此菌喜欢潮湿的环境。食品中主要在饮用水中存在，人饮用含有铜绿假单胞菌污染的饮用水后会导致食源性疾病，对免疫力低下或丧失免疫力的患者來说具有较高的致病风险。近年来，包装饮用水凭借饮用方便、水质洁净等优势，迅速进入了家庭及办公场所，国内外关于包装饮用水受铜绿假单胞菌污染的报道也日渐增多[1]。所以应加强对包装饮用水中铜绿假单胞菌的检验，而检验准确是保证食品安全的有力手段。

能力验证是利用实验室间比对来确定实验检测能力的活动，是实验室质量控制的重要手段。它是确保实验室检测结果准确性和提高检测水平的重要手段。为提高本中心微生物室检验能力，增强本中心市场竞争力，本中心微生物室参加了中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的矿泉水中铜绿假单胞菌的检测能力验证，本实验室采用国家标准GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》进行检验。通过本次能力验证，发现国家标准GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》存在的描述问题，提出解决方案，为准确计数铜绿假单胞菌提出操作指导。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供（编号为19-P370、19-Q883）;铜绿假单胞菌（ATCC 27853）购自环凯微生物科技有限公司。

1.2 试剂

假单胞菌琼脂基础培养基（CN）、营养琼脂、氧化酶试纸、乙酰胺肉汤、钠氏试剂、绿脓菌素测定培养基（北京陆桥技术股份有限公司）;0.45 μm滤膜与滤杯（环凯）。

1.3 仪器

生化培养箱（美墨尔特）;多联过滤系统（环凯微生物科技有限公司）;高压灭菌器（施都凯仪器设备公司）暗箱式自动紫外分析仪（上海市安亭电子仪器厂）。

2 实验方法

2.1 样品处理

根据ASAC-PT551（2018）矿泉水中铜绿假单胞菌的检测能力验证作业指导书处理样品，在生物安全柜中打开西林瓶，从已灭菌的520 mL无菌水中吸取5 mL无菌水，溶解西林瓶中的样品，将西林瓶中的水靠近火焰倾注到无菌的1 000 mL三角瓶中，重复此操作3次，同时用移液枪吸取5 mL无菌水冲洗西林瓶盖于无菌的

1 000 mL三角瓶中，最后将剩余的无菌水全部倾注到无菌的1 000 mL三角瓶中，能力验证作业指导书称此溶液为原液。从原液中吸取25 mL置于225 mL无菌水，涡旋1 min，此溶液为1∶10稀释液，从稀释液中吸取25 mL置于225 mL无菌水中，涡旋

1 min，此溶液为1∶100稀释液。在日常实验中，铜绿假单胞菌污染程度比较严重，CN板上比较多，不容易准确计数，所以选取3个浓度检测此次能力验证样品中的铜绿假单胞菌[2]。

2.2 样品过滤与培养

在过滤泵头放置无菌的0.45 μm的滤膜，光面朝上，取250 mL原液、1∶10稀释液、1∶100稀释液加入到250 mL的滤杯中真空隔膜泵过滤，过滤杯中的待测液和稀释液全部过滤后，用无菌水冲洗过滤杯3次，将过滤后的滤膜贴平铺在CN琼脂平皿上，正面朝上且不能有气泡。将贴好滤膜的CN琼脂平皿倒置放入到36 ℃培养箱中培养。

2.3 观察

培养24 h后观察培养基，记录菌落形态，24 h后培养基上有菌落长出，计数菌落。再培养24 h，记录菌落形态，发现此时许多菌落开始生长，有的已经连在一起，有的菌落此时产绿脓，菌落颜色为绿色，有的菌落为无色、乳白色、淡绿色或黄色。

2.4 可以菌落的验证

每个平板挑取在紫外灯下产荧光的菌落10个，在营养琼脂上纯化培养18 h，做氧化酶实验，同时接种到乙酰胺肉汤中在36 ℃西安培养24 h后，添加2滴纳氏试剂后观察乙酰胺肉汤管中颜色变化（颜色由深黄色到砖红色则为阳性，其余为阴性）。绿色的菌落接种到绿脓菌素测定培养基中在

36 ℃下培养24 h，加入三氯甲烷

3～5 mL，三氯甲烷呈粉红色到紫红色。选取的产荧光的20个菌落氧化酶为阳性，乙酰胺肉汤为阳性，绿脓菌素为阳性。

3 结果

通过在CN培养基上在36 ℃下培养24 h计数所有产荧光的菌落，48 h后再次记录产绿和产荧光的菌落，选择产荧光的菌落进行氧化酶实验、乙酰胺肉汤实验，对产绿脓的菌进行绿脓菌素验证实验，本实验报出此次能力验证结果19-P370为21 000 CFU/250 mL，19-Q883为19 000 CFU/250 mL。19-P370的Z值为0.6，19-Q883 Z值为0.8，能力验证结果为满意。

4 讨论

能力验证是实验室外部质控的手段之一，通过参加能力验证可提高检验员的检验水平和实验室检验能力。本中心此次能力验证结果为满意。通过参加能力验证本实验室发现了国家标准GB8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》检验铜绿假单胞菌中存在的问题，总结检验铜绿假单胞菌的关键点，指导日常实验工作。

（1）国家标准中检验水中铜绿假单胞菌时没有要求稀释样品，在日常检验中发现，检验污染较严重的水时，铜绿假单胞菌在过滤膜上生长的很多，无法计数，应该对其进行稀释，是从25 mL稀释到225 mL。

（2）乙酰胺肉汤的判读，国家标准中铜绿假单胞菌在乙酰胺肉汤中培养24 h后，加入纳氏试剂后，颜色由深黄色到砖红色。实验中发现空白乙酰胺肉汤加入纳氏试剂后最终也能变为砖红色。实验中发现水中存在铜绿假单胞菌时，只要加入纳氏试剂立即就会变为砖红色。

（3）国家标准要求菌落为绿色时，需要做绿脓素测定实验，在日常实验中发现，在CN上绿色的菌，绿脓菌素均为阳性。

（4）可疑菌的纯化生化鉴定。国家标准要求尽可能将所有经滤膜过滤后的可疑菌落在营养琼脂上纯化培养后进行生化鉴定。如果水污染严重，进行纯化鉴定的工作量非常大，且没有必要。本中心参照GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》第二法中大肠菌群的生化鉴定：挑取10个可疑菌落进行生化分析，根据比例计算铜绿假单胞菌个数。

（5）CN培养基培养24 h时需要记录产荧光的菌落，日常实验中发现铜绿简单胞菌在CN培养基上培养24 h后可以产荧光，但产生绿脓素需要48 h，但CN培养48 h，铜绿假单胞菌会变大，菌落之间会粘连，不易计数。本中心在实验中选择24 h计数一次，48 h计数一次，观察产绿脓情况。

参考文献

[1]苏粉良，徐振东，陈雨欣.苏州市包装饮用水中铜绿假单胞菌污染调查[J].江苏预防医学，2019，5（30）：326-327.

[2]王燕梅，唐震，乔昕，等.江苏省桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况调查[J].中国卫生检验杂志，2015，25（12）：2019-2020.