锌对EBPR系统除磷性能的影响及其机制

吴礼贵，邹小明，杨方社，龚锦程，黄 浩，曾庆华 ，张传庭

（1.西北大学城市与环境学院，陕西西安710127；2.井冈山大学生命科学学院，江西吉安343009）

我国水体富营养化问题较为突出，许多河湖都 出现了水体富营养化现象，而导致水体富营养化的主要元素是排放的工业生产废水及生活污水中的磷元素〔1〕。为解决水体富营养化问题，我国对污（废）水排放标准中磷的去除提出了更高的要求。目前，国内外常用的污（废）水除磷方法主要有生物除磷和化学除磷。其中，生物法中的强化生物除磷（EBPR）工艺因具有经济高效且污泥产量低等特点，在世界各地的污水处理厂中被广泛采用〔2〕。EBPR系统中一类能够在厌氧条件下释磷、好氧条件下过量吸磷的微生物——聚磷菌（PAOs）在除磷过程中起着重要作用。PAOs能够在厌氧条件下将可挥发性脂肪酸（VFAs）转化为聚羟基烷酸酯（PHA）储存在体内，糖原的降解为此过程提供还原力。在之后的好氧阶段，PAOs分解PHA产生能量，并利用此能量吸收水中的磷酸盐及合成糖原〔3〕。由于PAOs在好氧段的吸磷量大于厌氧段的释磷量，故可通过在好氧结束时排放含磷污泥达到除磷的目的。

在污水处理过程中，Zn2+被频繁检出。工业废水中的 Zn2+可达 30~300 mg/L〔4〕。 Zn2+存在于污水处理系统中，可能会对系统中的功能微生物（聚磷菌、硝化菌及反硝化菌等）造成不良影响，进而影响系统的污染物净化能力。现阶段，已有学者开展了Zn2+对污水处理工艺脱氮除磷性能影响的研究〔5〕。然而，Zn2+对EBPR系统的影响及其作用机理尚不清楚。

为此，本研究采用活性污泥构建EBPR除磷体系，探究了如下几个问题:（1）Zn2+对EBPR系统除磷性能的影响；（2）Zn2+对PAOs代谢中间产物的影响；（3）Zn2+对与PAOs除磷密切相关的关键酶〔多聚磷酸盐激酶（PPK）、多聚磷酸盐酯酶（PPX）及腺苷酸激酶（ADK）〕活性以及细胞膜完整性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验用泥及实验废水

实验接种污泥取自吉安市新源污水处理厂，该污泥具有良好的脱氮除磷性能。实验模拟废水组成见表1。以CH3COONa作为单一碳源（COD为400 mg/L），KH2PO4为磷源〔可溶性正磷酸盐（SOP）为 10 mg/L〕，NH4Cl为氮源（NH4+-N 为 20 mg/L）。 C4H8N2S用于抑制硝化细菌的生长。所用化学试剂均购自上海阿拉丁有限公司，为分析纯。

1.2 反应器构建及运行

聚磷菌富集实验在有效容积50 L的序批式反应器（SBR）中进行，进水体积为25 L，实验装置如图1所示。每昼夜运行3个周期，1个周期包括进水10 min、厌氧 2 h、好氧 3 h、沉淀 1 h、排水 10 min 及闲置100 min。反应器污泥龄控制在15 d左右。厌氧段 DO 控制在（0±0.1）mg/L，好氧段 DO 控制在（6.5±0.5）mg/L，反应器放置在（21±1）℃的恒温室中。 聚磷菌富集期间定期检测反应器水质变化。活性污泥经过40 d左右的培养驯化后，系统释磷、吸磷量稳定，除磷率达到且稳定在90%以上，符合EBPR工艺运行条件。从该反应器中取出5 L活性污泥混合液，离心（4 000 r/min，5 min）去除上清液，然后用质量分数为0.9%的NaCl溶液清洗3次，重悬浮于500 mL蒸馏水中，分装至5个小型SBR反应器中。分别加入500 mL人工模拟废水，再加入Zn2+溶液使得反应器中 Zn2+质量浓度分别为 0（对照组）、3、10、30、100 mg/L，最后用去离子水补至1 L。各反应器MLSS为（4 000±103）mg/L，MLVSS 为（3 550±78）mg/L。 反应器运行1个周期，运行条件与聚磷菌富集实验一致。

表1 实验模拟废水组成

图1 SBR实验装置示意

1.3 测定方法

SOP采用钼锑抗分光光度法进行测定〔6〕；COD采用重铬酸钾法进行测定〔6〕；DO采用便携式溶解氧仪测定；糖原采用蒽酮法进行测定〔7〕。PPK、ADK和PPX酶活性的测定参照文献〔8〕，所有酶活性均基于蛋白质含量，蛋白质含量的测定采用Folin-酚法。通过乳酸脱氢酶（LDH）活性来表征细胞膜完整性〔9〕，LDH活性采用南京建成公司试剂盒测定。PHA的含量采用气相色谱法测定〔10〕。气相色谱仪为TM7900II型（天美科学仪器有限公司），配置氢火焰离子化检测器，载气为氮气，色谱柱为TM-5柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）；进样器和检测器温度为220℃，采用程序升温:起始柱温80℃，停留2 min；然后以8℃/min速度升温至140℃，停留3 min。一个样品的运行时间约10 min，进样量1μL。

1.4 数据处理

实验数据以平均值±标准偏差来表示。应用SPSS25.0软件对实验结果进行单因素方差分析，差异显著性水平p<0.05。

Zn2+对EBPR系统除磷的抑制率计算公式:

式中:I——Zn2+对EBPR系统除磷的相对抑制率，%；

R0——对照组除磷率；

R——投加Zn2+后反应器除磷率。

利用Origin 2019函数数据库中的Hill方程对Zn2+毒性剂量效应进行拟合，采用模型决定系数（R2）、加权卡方检验系数（Reduced Chi-Sqr）来评价模型拟合的效果。

2 结果与讨论

2.1 Zn2+对EBPR系统SOP去除及转化的影响

依据实验方法，研究了Zn2+对EBPR系统SOP去除的影响，结果如图2所示。

图2 Zn2+对EBPR系统除磷性能的抑制作用

由图2可知，当Zn2+质量浓度为3 mg/L时，对EBPR系统的除磷抑制作用不明显（p>0.05），抑制率的平均值为2.06%。随着Zn2+浓度的增加，EBPR系统的除磷抑制率也不断升高。当Zn2+质量浓度从10 mg/L增加至100 mg/L时，系统除磷平均抑制率从40.72%升高至98.05%。基于Zn2+浓度与抑制效应关系，采用Hill方程进行拟合计算（R2为0.999，Reduced Chi-Sqr为0.29），发现Zn2+对EBPR系统除磷的IC50为11.28 mg/L。

此外，依据实验方法，研究了不同浓度的Zn2+暴露于EBPR系统1个周期（8 h）内SOP浓度的变化，结果如图3所示。

图3 Zn2+对EBPR系统SOP转化的影响

由图3可知，当Zn2+质量浓度为3 mg/L时，系统的磷释放和磷吸收能力均未受到显著影响（p>0.05）；当Zn2+质量浓度增加到10 mg/L时，系统厌氧释磷和好氧吸磷量均明显降低（p<0.05）；当Zn2+质量浓度增加到30 mg/L及100 mg/L时，系统释磷、吸磷能力进一步减弱，厌氧释磷平均抑制率分别为51.60%、94.83%，好氧吸磷平均抑制率分别为63.99%、96.48%。

实验结果表明，Zn2+短期暴露对EBPR系统除磷性能的影响是由Zn2+浓度决定的，较高浓度的Zn2+对PAOs的释磷及吸磷进程均存在抑制作用。

2.2 Zn2+对PAOs代谢中间产物的影响

PHA及糖原是PAOs代谢的关键物质，PHA的大量积累是PAOs在好氧条件下超量吸磷的保证，且以乙酸钠作为碳源时，PHA的成分主要为3-羟基丁酸酯（PHB）和 3-羟基戊酸酯（PHV）〔11〕。 为探究Zn2+对PAOs体内中间代谢产物转化的影响，依据实验方法，研究了Zn2+暴露于EBPR系统1个周期（8 h）内系统中PHA及糖原含量的变化，结果分别如图4、图5所示。

实验结果表明，当Zn2+质量浓度为3 mg/L时，PHA及糖原的转化曲线与对照实验组相比几乎相同。当Zn2+质量浓度≥10 mg/L时，厌氧段PHA的合成、糖原的降解几乎被完全抑制。相比于对照实验组，投加10~100 mg/L的Zn2+，PHA的合成平均抑制率为82.87%~95.59%。在好氧段，当Zn2+质量浓度为10、30 mg/L时，尽管糖原的合成几乎被完全抑制，但仍存在PHA的降解；当Zn2+质量浓度增至100 mg/L，PHA的降解、糖原的合成几乎被完全抑制。此外，研究表明，各反应器活性污泥中PHB占PHA的绝大部分，如对照组中PHA合成量的平均值为4.99 mmolC/gVSS，其中PHB合成量为3.72 mmolC/gVSS，占比平均值达74.55%。

图5 Zn2+对EBPR系统中糖原含量的影响

综上，较高浓度Zn2+对EBPR系统活性污泥中PHA及糖原的代谢均有抑制作用，最终导致系统除磷性能减弱。较高浓度Zn2+的存在抑制了PAOs厌氧时多聚磷酸盐的分解及糖原的降解，从而减少了PHA合成所需的能量、还原力，使得PHA的合成受到影响，导致在好氧段没有足够的PHA降解产生能量供PAOs吸收水中的磷酸盐。贾利涛等〔5〕也发现，随着Zn2+浓度的升高，单级好氧工艺活性污泥中的PHA合成量与降解量均逐渐减少，除磷效率降低。任志群〔12〕的研究表明，高浓度（25 mg/L）纳米ZnO短期暴露于SBR系统对其除磷性能有显著不利影响，系统中PHA的合成与降解受到影响，且糖原的变化幅度更大。虽然其采用的研究对象为纳米ZnO，但有研究表明，Zn2+的释放是导致纳米ZnO产生毒性的主要原因〔13〕。其实验结果中糖原变化与本研究存在差异，可能是由反应器中聚糖菌微生物的丰度差异所导致。

2.3 Zn2+对EBPR系统除磷关键酶活性及细胞膜完整性的影响

PPX、PPK 及 ADK 是 PAOs除磷的关键酶〔8〕，其中，ADK能与一磷酸腺苷反应生成二磷酸腺苷（ADP），从而生成三磷酸腺苷（ATP），为生物代谢提供能量，此过程是聚磷酸盐水解的关键反应。PPX和PPK分别在厌氧段分解多聚磷酸盐及好氧段合成多聚磷酸盐中起关键作用。依据实验方法，研究了Zn2+暴露于EBPR系统1个周期内系统中PPX、PPK、ADK活性及LDH释放量的变化，结果如图6所示。

图 6 Zn2+对 EBPR 系统中 PPX、PPK、ADK 活性（a）及LDH 释放量（b）的影响（* 表示 p＜0.05；** 表示 p＜0.01）

实验结果表明，较高浓度的Zn2+对PAOs中PPX、PPK及ADK活性均有抑制作用，且随着Zn2+浓度的升高，抑制作用增强〔图 6（a）〕。当 Zn2+质量浓度为 3 mg/L时，3种酶活性与对照组相比均无显著性差异（p＞0.05）。 而当 Zn2+质量浓度为 10 mg/L 时，ADK 活性下降至对照组的76.83%，与对照组相比存在显著差异（p＜0.05）；PPX、PPK活性下降至对照组的 65.33%、52.48%，较对照组有极显著性差异（p＜0.01）。当Zn2+质量浓度增加到30、100 mg/L时，3种酶活性几乎被完全抑制。较高浓度Zn2+抑制3种酶活性的现象与厌氧段释磷及好氧段吸磷受到的影响一致。因此可得出结论，较高浓度的Zn2+对EBPR系统中除磷关键酶（PPX、PPK和ADK）的抑制作用是导致EBPR系统除磷性能降低的重要原因。

现已知金属离子对酶的抑制机理有以下几方面:（1）进入细胞内的重金属与蛋白酶活性中心的—SH发生反应，或与其他非活性中心部分结合导致酶结构发生变化，致使酶活性减弱甚至失活〔14〕；（2）重金属诱导产生的自由基和活性氧（ROS）抑制了酶活性〔8〕。

细胞膜是ROS攻击的重要靶点。根据实验结果，Zn2+（3～100 mg/L）短期暴露对 EBPR 系统中微生物细胞膜完整性未造成显著影响〔图6（b）〕，说明机理（1）导致3种酶活性降低的可能性更大。Xiong Zheng等〔15〕的研究也表明，虽然10 mg/L以上的纳米ZnO对SBR系统脱氮除磷有抑制作用，但未对系统中微生物的细胞膜完整性造成显著影响。如前所述，众多研究表明，Zn2+的释放是造成纳米ZnO产生毒性的主要因素，故可认为该结果与本实验结果相一致。但也有研究发现，长期投加10 mg/L纳米ZnO可破坏活性污泥系统中微生物细胞膜的完整性〔16〕。Zn2+长期暴露对EBPR系统中微生物细胞膜的影响仍需作进一步探究。

3 结论

采用活性污泥构建EBPR体系，研究了Zn2+短期暴露对EBPR系统除磷性能的影响及其作用机理，得到如下结论:

（1）当Zn2+质量浓度为3 mg/L时，其对EBPR系统除磷性能无显著影响；当Zn2+质量浓度为10 mg/L时，对系统的除磷抑制作用明显，相比于对照组，平均抑制率为40.72%；当Zn2+质量浓度增加到30、100 mg/L时，平均抑制率分别升至94.30%、98.05%。

（2）较高浓度的 Zn2+（≥10 m/L）会影响 PAOs的释磷及吸磷能力，且会抑制PHA、糖原的正常代谢，进而影响好氧段PAOs分解PHA产生的能量，降低吸磷能力。

（3）较高浓度的 Zn2+（≥10 m/L）会抑制 EBPR 系统中除磷关键酶ADK、PPX和PPK的活性，从而对PAOs厌氧释磷和好氧吸磷造成影响，降低系统的除磷性能。Zn2+（3~100 mg/L）短期暴露对EBPR系统中微生物细胞膜完整性无显著影响。