纤溶酶原激活物抑制物-1对棕榈酸刺激后小鼠原代心肌细胞凋亡的作用及机制

裴培，成小丽，邢瑞楠，田孝祥，刘丹

北部战区总医院心内科，沈阳 110016

心血管疾病是人类致死致残的主要原因之一。大量研究表明，心肌细胞凋亡在许多心血管疾病如心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤及糖尿病心肌病的发生发展中发挥重要作用[1-4]。在糖尿病心肌病中，过量的饱和脂肪酸如棕榈酸可通过诱导心肌细胞凋亡导致心功能异常及心力衰竭。因此，明确调控棕榈酸诱导心肌细胞凋亡的关键分子及相关机制，可为糖尿病心肌病等心血管疾病的防治提供理论依据和线索。

纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，广泛表达于各组织及器官，如心脏、肝脏、肺脏及肾脏[5-7]。PAI-1可抑制纤溶酶原系统，并通过调节基质金属蛋白酶的活化来抑制胶原及纤维蛋白的清除。因此，PAI-1被认为是一个促纤维化蛋白，在组织重构中发挥重要作用[8]。研究发现，心肌组织中PAI-1表达升高与心肌纤维化及心室重构密切相关[9-10]。此外，PAI-1还是心血管疾病的一个独立危险因素[11-12]。以上研究均表明，PAI-1在心血管疾病中具有重要作用。然而，PAI-1在糖尿病心肌病及棕榈酸刺激后心肌细胞凋亡中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨PAI-1对棕榈酸刺激后心肌细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 原代心肌细胞提取试剂盒(Thermo公司，美国)，小鼠PAI-1基因小干扰RNA及转染对照试剂(Santa Cruz公司，美国)，RNA提取试剂盒(Promega公司，美国)，反转录试剂盒(TakaRa公司，日本)，PAI-1抗体、β-tublin抗体(Abcam公司，美国)，剪切型的半胱天冬酶3(cleaved-caspase 3)、 BCL2关联X蛋白(Bax)抗体、核因子κB(NF-κB)均购自美国CST公司，磷酸化NF-κB(p-NF-κB)抗体(Selleck公司，美国)，NF-κB抑制剂Bay11-7082 (Selleck公司，美国)。

1.2 小鼠原代心肌细胞的提取及培养 选取出生1～3 d的小鼠乳鼠，采用原代心肌细胞提取试剂盒进行心肌细胞提取。将心肌细胞吹散成单细胞悬液，加入含20%胎牛血清的DMEM培养基，在6孔板中进行培养，显微镜下观察细胞的生长 状态。

1.3 细胞转染及分组 ①待小鼠原代心肌细胞贴壁24 h后，将细胞分为对照组及棕榈酸组(400 μmol/L)，刺激24 h后收集细胞，检测PAI-1、cleaved-caspase 3及Bax蛋白的表达。②建立过表达PAI-1及低表达PAI-1的心肌细胞：将小鼠PAI-1基因cDNA序列插入到pcDNA3.1(+)载体，构建PAI-1过表达质粒。细胞分为对照组与PAI-1过表达组，在细胞密度为90%时，应用Lipofectamine 3000转染试剂将质粒转染至细胞中，转染24 h后收集细胞。将小鼠PAI-1基因的小干扰RNA分为对照组与PAI-1低表达组，待细胞融合至90%时，采用转染试剂Lipofectamine RNAi max将PAI-1小干扰RNA及转染对照试剂转染至细胞中，24 h后收集细胞。检测上述各组细胞PAI-1、cleaved-caspase 3及Bax的表达水平。③确定PAI-1小干扰RNA转染条件后，给予棕榈酸刺激24 h后，检测PAI-1、cleaved-caspase 3、Bax、p-NF-κB及NF-κB表达水平。具体分组如下：对照组、PAI-1低表达组、棕榈酸组、PAI-1低表达+棕榈酸组。④在PAI-1低表达的基础上给予NF-κB抑制剂Bay11-7082预处理，给予棕榈酸刺激24 h后，检测p-NF-κB及NF-κB的表达水平。具体分组如下：棕榈酸组、PAI-1低表达+棕榈酸组、Bay11-7082 +棕榈酸组、PAI-1低表达+Bay11-7082+棕榈酸组。

1.4 荧光定量PCR检测PAI-1基因mRNA表达 采用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。采用反转录试剂盒对500 ng总RNA进行反转录获取cDNA。采用SYBR Green方法对cDNA行荧光定量PCR扩增PAI-1及内参照GAPDH。引物序列：PAI-1， 正向5'-CA AGCTCTTCCAG A TATGGTG-3'，反向5'-ACCTTTG GTATG CCTTTCC AC-3'；GAPDH，正向5'-CCAGGCGCCCAATACG-3'，反向5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3'。结果以Ct值表示，根据公式2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。

1.5 Western blotting检测PAI-1、cleaved-caspase 3、Bax及p-NF-κB蛋白的表达水平 采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA方法测定蛋白浓度。以SDSPAGE胶对蛋白(30 μg)进行电泳。一抗采用抗PAI-1抗体、cleaved-caspase 3抗体、Bax抗体、p-NF-κB及NF-κB抗体，二抗使用HRP标记的抗体，以β-tublin为内参照。使用Image-Pro Plus 6.0软件分析条带的灰度值。

1.6 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 棕榈酸刺激对心肌细胞凋亡蛋白及PAI-1表达的影响 棕榈酸组的cleaved-caspase 3、Bax及PAI-1蛋白表达水平(灰度值分别为4912.42±383.71、2942.63±440.07、3725.12±419.13)均明显高于对照组(灰度值分别为390.91±59.50、990.21±174.53、1973.51±371.82)，差异有统计学意义(P<0.01， 图1)。

图1 Western blotting检测棕榈酸刺激心肌细胞24 h后凋亡蛋白及PAI-1蛋白的表达Fig.1 Expressions of apoptotic protein and PAI-1 in cardiomyocytes 24 h after palmitate stimulation (Western blotting)

2.2 过表达PA I-1 及低表达PA I-1 心肌细胞模型的建立 PA I-1过表达组的PA I-1 mR NA(Ct值为2 0.4 2±0.2 0)及蛋白表达水平(灰度值为6641.37±163.11)均明显高于其对照组(Ct值为21.77±0.38，灰度值为2681.14±153.85)，差异有统计学意义(P<0.01，图2A)。同时，PAI-1低表达组的PAI-1 mRNA(Ct值为24.12±0.88)及蛋白表达水平(灰度值为752.04±94.95)均明显低于其对照组(Ct值为23.10±0.46，灰度值为2916.96±91.74)，差异有统计学意义(P<0.01，图2B)。

图2 过表达PAI-1及低表达PAI-1心肌细胞模型的建立Fig.2 Establishment of cardiomyocyte models with PAI-1 low expression and PAI-1 over expression

2.3 PAI-1对心肌细胞凋亡蛋白cleaved-caspase 3及Bax表达的影响 与相应对照组(灰度值分别为3826.05±282.99、3084.98±332.20)比较，PAI-1低表达组及过表达组cleaved-caspase 3蛋白表达水平无明显变化(灰度值分别为3388.04±527.29、3036.08±121.37，P>0.05)；与相应对照组比较(灰度值分别为5251.56±147.65、5501.67±360.17)，PAI-1低表达组及过表达组Bax蛋白表达水平(灰度值分别为5412.62±172.24、5640.58±149.82)也无明显变化(P>0.05，图3A)。

与对照组(灰度值分别为2312.43±225.36、2 5 3 6.6 4±4 9 0.2 2)相比，P A I-1 低表达组cleaved-caspase 3及Bax蛋白表达(灰度值分别为2295.33±162.84、2563.03±217.80)和PAI-1低表达+棕榈酸组cleaved-caspase3及Bax蛋白表达(灰度值分别为2384.41±269.31、2741.56±373.87)无明显变化(P>0.05)，而棕榈酸组cleaved-caspase 3及Bax蛋白表达(灰度值分别为6235.98±482.49、6998.4±162.87)明显升高，差异有统计学意义(P<0.01，图3B)；与PAI-1低表达组相比，棕榈酸组cleaved-caspase 3及Bax蛋白水平明显升高(P<0.01)，而PAI-1低表达+棕榈酸组无明显变化(P>0.05)；与棕榈酸组相比，PAI-1低表达+棕榈酸组cleaved-caspase 3及Bax蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01，图3B)。

2.4 PAI-1对棕榈酸刺激后心肌细胞p-NF-κB表达的影响 与对照组(灰度值为3473.03±436.06)相比，PAI-1低表达组及PAI-1低表达+棕榈酸组p-NF-κB表达(灰度值分别为3523.33±360.36、3826.64±461.61)差异均无统计学意义(P>0.05)，而棕榈酸组p-N F-κ B 蛋白表达水平(灰度值为9035.07±526.88)明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与PAI-1低表达组相比，棕榈酸组p-NF-κB 蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，而PAI-1低表达+棕榈酸组的p-NF-κB蛋白表达水平无明显变化；与棕榈酸组相比，PAI-1低表达+棕榈酸组p-NF-κB表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.01，图4)。

图4 PAI-1对棕榈酸诱导后心肌细胞磷酸化NF-κB蛋白表达的影响Fig.4 Effect of PAI-1 on the expression of phosphorylated NF-κB protien in cardiomyocytes after palmitate stimulation

2.5 NF-κB抑制剂Bay11-7082对棕榈酸刺激后心肌细胞凋亡蛋白表达的影响 与棕榈酸组(灰度值分别为9838.07±1025.45、9735.50±1088.19)相比，PA I-1 低表达+棕榈酸组(灰度值分别为3169.20±163.68、4732.07±181.28)、Bay11-7082+ 棕榈酸组(灰度值分别为3 2 1 8.7 7±2 4 9.1 7、4838.87±283.33)、PAI-1低表达+Bay11-7082+棕榈酸组(灰度值分别为4 3 5.2 0±9 9.8 7、1275.63±226.74)cleaved-caspase 3及Bax表达水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与PAI-1低表达+棕榈酸组相比，Bay11-7082+棕榈酸组cleavedcaspase 3及Bax表达水平无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，而PAI-1低表达+Bay11-7082+棕榈酸组cleaved-caspase 3及Bax表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与Bay11-7082+棕榈酸组相比，PAI-1低表达+Bay11-7082+棕榈酸组cleavedcaspase 3及Bax表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01，图5)。

图5 Bay11-7082对棕榈酸诱导后心肌细胞凋亡蛋白表达的影响Fig.5 Effect of Bay11-7082 on the expression of apoptotic protein in cardiomyocytes after palmitate stimulation

3 讨 论

心肌细胞凋亡是许多心血管疾病的共同病理基础[13]，包括心肌梗死、心力衰竭及糖尿病心肌病 等[14-15]。越来越多的研究关注心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病中的作用[16-17]，但影响糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的分子及其机制仍有待阐明[18]。

本研究采用棕榈酸刺激小鼠原代心肌细胞来建立糖尿病心肌病的细胞模型。结果发现，棕榈酸刺激后心肌细胞凋亡明显增加，同时PAI-1表达也明显增加，提示PAI-1与心肌细胞凋亡有关。为进一步明确PAI-1在棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡中的作用，本研究分别建立PAI-1过表达及低表达的心肌心肌细胞模型，检测凋亡蛋白的表达，结果发现，在正常生理情况下PAI-1对心肌细胞凋亡无影响，在PAI-1低表达基础上给予棕榈酸刺激，心肌细胞凋亡蛋白表达明显下降，提示低表达PAI-1可抑制棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡。

研究表明，NF-κB通路在维持正常心肌细胞生存及心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用[19-21]。本研究发现，棕榈酸刺激后心肌细胞中p-NF-κB表达明显升高，而PAI-1低表达后可抑制棕榈酸诱导的p-NF-κB表达升高，且上述作用可被NF-κB抑制剂Bay11-7082抑制，说明PAI-1可通过NF-κB通路参与棕榈酸对心肌细胞凋亡的调控。但PAI-1与NF-κB之间的直接调控分子及PAI-1的上游调控分子尚不 清楚。

miRNA是一类序列保守的非编码单链RNA分子，通过负性调控靶基因的表达发挥相应的生物学效应[22-23]。已有文献报道，PAI-1可作为miR-143的直接下游靶基因影响骨肉瘤的转移及侵袭，同时还可作为miR-335-5p的靶基因参与下肢深静脉血栓的发生[24-25]。但PAI-1是否受到一个或多个miRNA的调控从而参与棕榈酸对心肌细胞凋亡的影响目前尚不明确。本研究主要在细胞水平模拟糖尿病心肌病模型，研究PAI-1对细胞凋亡的影响，与疾病模型还存在一定差异。为深入探讨在糖尿病心肌病状态下PAI-1的作用，下一步工作将集中在动物模型水平，采用高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素的方法建立糖尿病心肌病动物模型，明确PAI-1表达变化与糖尿病心肌病的关系，并通过构建PAI-1相关腺病毒，在体研究PAI-1对糖尿病心肌病发生发展的 影响。

综上所述，本研究结果表明，棕榈酸可导致心肌细胞中PAI-1及凋亡蛋白表达增加，低表达PAI-1可通过调控NF-κB通路抑制棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡。