长链非编码RNA在肝癌化疗耐药中的研究进展

唐贵菊，田塬，王继婷，苏松，宋敏，李亚玲

1西南医科大学药学院临床药学系，四川泸州 646000；2西南医科大学附属医院肝胆科，四川泸州 646000；3西南医科大学附属医院医学检验部，四川泸州 646000；4西南医科大学附属医院药学部，四川泸州 646000

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第5位的恶性肿瘤性疾病，2018年其致死人数占癌症死亡总数的8.2%[1]。我国是肝癌高发国家，肝癌患者占全球50%以上。肝癌早期症状不明显，病灶隐匿且发展迅速，致使大多数患者在临床确诊时已属中晚期甚至已发生转移，不能行根治性手术切除[2]，因此化疗成为中晚期肝癌的主要治疗方法之一[3]。近年来，肝癌化疗药物呈现多元化(如阿霉素、顺铂、丝裂霉素、氟尿嘧啶、奥沙利铂等)，并由单一药物发展为多种药物联合应用，提高了晚期肝癌患者的生存率，但长期用药产生的化疗耐药仍是亟待解决的关键问题。大量研究发现，长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)的异常表达与肝癌化疗耐药密切相关[4-6](表1)，可通过调控肝癌细胞的药物代谢、程序性死亡及肿瘤干细胞的自我更新等生物学活动参与肝癌化疗耐药。本文就lncRNAs参与肝癌化疗耐药的作用及机制进行 综述。

1 定义与分类

LncRNAs是真核细胞中一类转录本长度多于200个核苷酸的非编码RNA，由于缺乏开放阅读框，不具备编码蛋白质的功能[7]。但lncRNAs并非无 生物学功能的“噪音序列”[8-9]，而是具有潜在的生物学功能，与多种疾病的发生、发展、诊断和治疗密切相关。目前，lncR NA s已成为肿瘤耐药机制研究的热点[10-11]。近年来，随着人类基因组计划的完成和高通量基因组技术的建立，越来越多的lncR NA s被发现。根据基因组定位，lncRNAs可分为5类[8]：正义lncRNA(sense lncRNA)、反义lncRNA(an-tisence lncRNA)、双向lncRNA(bidirectional lncRNA)、内含子lncRNA(intronic lncRNA)和基因间lncRNA(intergenic lncRNA)。LncRNAs可通过信号、支架、诱饵、引导等方式在表观遗传、转录及转录后水平调控基因表达，参与多种肿瘤的发生、发展、浸润和转移等生物学活动，在肿瘤(包括肝癌)化疗耐药中发挥重要作用[12-15]。

表1 肝癌化疗耐药相关lncRNAsTab.1 Long non-coding RNA in chemotherapeutic resistance of hepatocellular carcinoma

2 调控肝癌细胞药物代谢

药物代谢反应主要包括氧化、还原、水解及结合反应等4种类型。其中氧化、还原和水解反应为Ⅰ相代谢反应：药物经过Ⅰ相代谢反应后极性增大(即水溶性增大)，易于排出体外；结合反应为Ⅱ相代谢反应：药物及其代谢物与一些内源性物质(如葡萄糖醛酸、甲基、硫基、甘氨酸等基团)结合，形成极性更强的物质，通过胆汁或尿液排出体外。2.1 细胞内药物清除 LncRNAs通过调控Ⅰ相代谢反应中的细胞色素P450酶系来清除细胞内药物，从而介导肝癌化疗耐药。在研究小鼠肝脏时发现，位于细胞色素氧化酶P450 4B1(CYP4B1)编码基因下游约40 kb处的lncRNA Gm12839与CYP4B1基因表达呈负相关[16]，表明lncRNA Gm12839可通过抑制CYP4B1基因的表达降低P450酶的水平，以减弱Ⅰ相代谢反应对药物的清除能力，逆转肝癌细胞的耐药性。

2.2 药物外排 除Ⅰ、Ⅱ相代谢反应外，药物代谢还包括逆浓度外排。肿瘤细胞中逆浓度外排是药物代谢诱发肿瘤细胞耐药的主要原因。LncRNAs调控药物代谢介导肝癌耐药的机制主要是通过药物外排，该过程与ATP结合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)超家族(一类ATP驱动泵，具有主动运输跨膜化合物的功能)密切相关。已有研究显示，ABC超家族的多个蛋白能与细胞内药物底物相结合，再结合膜上的ATP获得能量，最终将底物泵出细胞，从而降低细胞内药物浓度，导致细胞耐药[17]。研究发现，ABC超家族中B、C、G亚家族的ABCB1(multi-drug resistance 1，MDR1/P-gp)、ABCC1、ABCG2等成员参与了肿瘤细胞的多药 耐药。

2.2.1 调控ABCB1表达 P-糖蛋白(P-gp)是第一个被发现的ABC转运体，由多药耐药基因MDR1编码，在多种肿瘤细胞中高度表达。P-gp在肝癌细胞中高表达，可将胞内药物泵出，降低胞内药物浓度，导致细胞耐药。一项与多药耐药基因MDR1相关的研究发现，lncRNA H19可通过调节MDR1启动子甲基化，促进肝癌细胞HepG2中P-gp的表达[18]。敲低lncRNA H19可增强ABCB1启动子甲基化，抑制P-gp的表达，增强肝癌细胞对阿霉素的敏感性[19]。 在肝癌细胞SMMC-7721/ADM和HepG2/ADM中，敲低lncRNA TUG1或TUG1过表达均会影响P-gp的表达，从而影响肝癌细胞对阿霉素的耐药性[20]。此外，lncRNA HOTAIR在肝癌细胞Huh7中低表达，增强了肝癌细胞对顺铂的敏感性，分析其机制为：在敲低lncRNA HOTAIR的肝癌细胞Huh7中，ABCB1 mRNA和蛋白表达水平均降低，表明lncRNA HOTAIR可能通过调控ABCB1的表达而影响肝癌细胞对顺铂的敏感性[21]。总之，敲低lncRNA H19、TUG1和HOTAIR均可下调P-gp的表达，减少P-gp参与的药物外排，使胞内药物浓度增加，增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性，提示P-gp可能是逆转肝癌化疗耐药的一个靶点。

2.2.2 调控ABCC1表达 ABCC1又称多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance protein 1，MRP1)，被发现于阿霉素小细胞肺癌细胞株H69/AR中，在耐药细胞中的表达水平高于敏感细胞近100倍，是除P-gp外研究最多的多药耐药蛋白之一。有研究发现，在奥沙利铂耐药肝癌细胞(Huh7/OXA和HepG2/OXA)中，lncRNA NR2F1-AS1及ABCC1表达均上调，而miR-363表达下调，敲低lncRNA NR2F1-AS1可降低肝癌细胞对奥沙利铂的耐药性，表明lncRNA NR2F1-AS1可通过内源性应答miR-363促进ABCC1表达，从而影响肝癌细胞耐药[22]。综上，lncRNA可抑制ABCC1的表达，减少能与ABCC1结合的化疗药物的外排，抑制肝癌细胞的化疗耐药。2.2.3 调控ABCG2表达 ABCG2又称乳腺癌耐药蛋白，被发现于乳腺癌耐药细胞株中，其表达水平与乳腺癌化疗耐药密切相关。有研究发现，过表达的ABCG2参与了肝癌的多药耐药[23]。LincRNA VLDLR在肿瘤细胞中呈现高表达。暴露于不同的抗癌药物(如阿霉素和喜树碱)后，肝癌细胞及其释放的细胞外囊泡中的lncRNA VLDLR表达增加，提示lncRNA VLDLR与肝癌细胞的化疗敏感性相关；siRNA介导的lncRNA VLDLR敲低降低了ABCG2的表达及细胞存活率，阻滞了细胞周期进程[24]。ABCG2过表达减弱了lncRNA VLDLR敲低对阿霉素诱导的HepG2细胞死亡的作用，表明lncRNA VLDLR可能通过调控癌细胞内ABCG2的表达，促进化疗耐药。综上，lncRNA可抑制ABCG2的表达，致使药物外排作用减弱，抑制肝癌细胞的化疗耐药。

3 调控细胞程序性死亡

细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

3.1 调控细胞凋亡 细胞凋亡是一种生理性、程序性的细胞死亡过程。细胞凋亡受阻或丧失凋亡能力是肿瘤细胞产生耐药的重要诱因[25]。LncRNAs可通过调节生物酶活性、癌基因或抑癌基因和转录因子的表达等过程阻止肿瘤细胞在药物作用下凋亡，从而产生耐药性。

3.1.1 调节生物酶活性 糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)的一种亚型结构酶，其可作用于众多的信号蛋白、结构蛋白和转录因子，进而调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡。GSK-3β通过磷酸化糖原合成酶(glycogen synthase，GS)抑制GS的活性，影响血液中葡萄糖的浓度，调控Bax/HKII的比例，进而影响线粒体渗透性及细胞色素C的释放，参与细胞凋亡的调控。在肝癌细胞中，lncRNA HANR可直接结合GSK-3β反应蛋白(GSKIP)促进GSK-3β磷酸化，调控肝癌细胞的增殖和凋亡。敲低lncRNA HANR可抑制肝癌细胞的增殖及异种原位移植，诱导肝癌细胞凋亡，增强肝癌细胞对阿霉素的敏感性[26]。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物体内重要的抗氧化酶，是生物衰老与死亡的直观指标。相关研究显示，SOD活性与lncRNA H19表达水平及细胞活性均呈负相关，在肝癌细胞中，lncRNA H19表达下调可能通过阻断MAPK/ERK信号通路，诱导CD133+肿瘤干细胞的氧化应激，抑制肝癌细胞的化疗耐药[27]。GSK-3β和SOD均参与调控肝癌细胞凋亡，通过促进肝癌细胞凋亡，逆转肝癌的化疗耐药。总之，敲低lncRNA HANR及H19可通过影响GSK-3β和SOD活性抑制肝癌细胞生长，促进肝癌细胞凋亡，提示lncRNA HANR及H19是肝癌化疗耐药治疗的靶点。

3.1.2 调节癌基因或抑癌基因和转录因子表达 p53基因是一种与细胞凋亡密切相关的抑癌基因，可根据细胞受损程度和修复能力决定是否启动细胞凋亡。有研究显示，TNF-α/IL-6-lncRNA 00607-NFκB-p65/p53信号轴可作为肝癌化疗的一种新途径。LncRNA 00607可与p65启动子结合，抑制p65转录，导致肝癌细胞中p53水平升高，抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡，从而增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性[28]。此外，lncRNA NRAL(Nrf2调节相关的lncRNA)通过取代竞争性内源性RNA(ceRNA)miR-340-5p调控Nrf2的表达，敲低NRAL可抑制Nrf2的表达，增强HepG2/DDP的细胞毒性，促进耐药细胞凋亡[29]。由此可见，lncRNA 00607和NRAL可直接或间接发挥抑癌基因的作用，通过调控lncRNA 00607和NRAL可抑制肝癌细胞增殖，诱导肝癌细胞凋亡，逆转肝癌细胞的化疗耐药。

3.2 调控细胞自噬 细胞自噬是一种进化上保守的细胞降解过程，对肿瘤细胞具有双重作用。在肿瘤早期，自噬通过抑制炎症反应及促进基因组的稳定性，抑制肿瘤的发生和发展[30]；而作为一种细胞自我保护方式，自噬亦可保护癌细胞对抗外界各种不利因素的影响[31-32]。LncRNAs具有促进和抑制肿瘤细胞自噬的双重调节功能[33]，可通过调控胞内自噬相关蛋白的表达，影响肝癌化疗耐药。

微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)是自噬特异性标志分子，包含LC3Ⅰ和LC3Ⅱ两种类型，其表达水平高低间接反映了自噬活性的强弱。在肝癌细胞中，lncRNA HULC可通过下调成熟miR-15a的表达，上调p62的表达；lncRNA HULC过表达可通过激活Sirt1增加LC3和Becline-1(自噬相关基因)的表达，增强LC3与Atg3之间的作用，促进细胞自噬，增强肝癌细胞对奥沙利铂的耐药性[34]。LC3和p62作为自噬标志蛋白参与了整个自噬过程，是检测自噬活性的重要指标[35]。在肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU中，MALAT1分子可调控miR-216b，而敲低MALAT1或miR-216b过表达均可下调胞内LC3Ⅱ及p62蛋白的表达，表明MALAT1可通过自噬促进肝癌的化疗耐药[36]。 LncRNA HULC和MALAT1均可通过上调p62的表达促进细胞自噬，增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性。可见，在lncRNA调控肝癌耐药的过程中，p62起着至关重要的作用，提示p62是研究lncRNA通过自噬调控肝癌耐药机制的关键。

4 调控肿瘤干细胞的自我更新

肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。随机化理论(认为肿瘤细胞具有同质性，仅有少部分肿瘤细胞进入细胞分化周期)和分层理论(认为肿瘤细胞具有功能异质性，仅有限数目的肿瘤细胞进入细胞分化周期)均认为肿瘤组织中存在少量干细胞样的癌细胞亚群，该亚群具有自我更新、增殖及分化能力，在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着重要作用。这些细胞不仅可能逃逸抗肿瘤药物，且新生肿瘤可能具有耐药性。多种lncRNAs可通过多种信号通路介导肝癌干细胞(liver cancer stem cells，LCSCs)和肿瘤初始细胞(tumor initiating cell，TIC)的自我更新。因此，探究lncRNAs在LCSCs和TIC中的作用是研究lncRNAs、LCSCs的自我更新及肝癌细胞耐药三者间具体作用机制的前提。

4.1 参与Wnt信号通路的调节 Wnt信号通路是存在于肿瘤干细胞中的重要分子信号传导通路，与肿瘤的发生、转移、复发及耐药密切相关[37]。LincRNA 00210、TCF7、FZD6、β-Catm和THOR等可通过Wnt/β-catenin信号通路调控LCSCs和TIC的自我更新。LincRNA 00210可与CTNNBIP1结合，抑制CTNNBIP1的表达，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路，增强肝癌TIC细胞的自我更新能力[38]。LincRNA TCF7和FZD6均可将SWI/SNF复合物招募到相应受体(TCF7、FZD6)的启动子并调控其表达，从而激活Wnt信号，增强LCSCs或TIC的自我更新能力[39-40]。 LincRNA β-Catm可与β-catenin和EZH2结合，促进β-catenin甲基化，甲基化可抑制β-catenin泛素化并增强其稳定性，激活Wnt/β-catenin信号通路，增强LCSCs的自我更新能力[41]。LincRNA THOR可通过靶向β-catenin信号传导，激活Wnt/β-catenin信号通路，增强LCSCs的自我更新能力[42]。可见，多种lncRNAs可通过Wnt/β-catenin信号通路增强LCSCs的自我更新能力。LCSCs的自我更新能力越强，其逃逸化疗药物的可能性越大，且获得性耐药的概率越高。综上，通过调控lncRNAs可调节Wnt/β-catenin信号通路，抑制LCSCs及TIC的自我更新能力，增强肝癌的化疗敏感性。

4.2 参与STAT3信号通路的调节 信号传导与活化转录因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是信号传导活化转录因子家族的重要成员，在细胞中起传递信号和启动基因转录的作用。在LCSCs中，lncRNA DLX6-AS1的下调可增强Cadm1的表达，抑制STAT3信号通路和Cadm1启动子甲基化，从而抑制LCSCs的自我更新能力[43]。LncRNA Sox4与STAT3作用，可将后者招募至Sox4启动子并启动Sox4的表达；lncRNA Zic2可招募BRG1至MARCKS和MARCKSL1启动子并促进其表达，从而增强肝癌TIC的自我更新能力[44-45]。在顺铂耐药LCSCs中，过表达的lncRNA DILC可与IL-6启动子结合而抑制IL-6的表达；敲低lncRNA DILC可激活IL6/STAT3信号通路，增强LCSCs的自我更新能力[46]。LncRNA ARSR可通过STAT3通路促进LCSCs的自我更新，而抑制lncRNA ARSR的表达可在一定程度上增强肝癌细胞对顺铂的敏感性[47]，提示STAT3是逆转肝癌耐药的一个靶点，LCSCs的自我更新能力受到STAT3状态的调控。综上，lncRNAs参与STAT3信号通路的调节，调控lncRNAs可调节STAT3信号通路，抑制LCSCs的自我更新能力，从而逆转肝癌的化疗耐药。

4.3 参与BMP与YAP信号通路的调节 BMP信号通路在维持肿瘤干细胞特性方面起重要作用，是肿瘤发生可能的分子机制。LncRNA HAND2-AS1能招募INO80染色质重塑复合物至BMPR1A启动子并诱导其表达，激活BMP信号，增强LCSCs的自我更新能力[48]。YAP信号通路的激活可增强干细胞的自我更新能力。研究发现，lncRNA ARSR表达上调可通过调节PTEN-PI3K/Akt信号通路，促进肝癌细胞对阿霉素的耐药性，增强LCSCs的自我更新能力[49]。lncRNA BRM在LCSCs和肝癌细胞中高度表达，且LCSCs的自我更新和肝癌的发生均需要lncRNA BRM。研究发现，lncRNA BRM可与BRM结合，启动BRG1/BRM开关，BRG1嵌入的BAF复合物可激活YAP1信号[50-51]。可见，BMP与YAP信号激活均会增强LCSCs的自我更新能力。综上，调控lncRNA可调节BMP和YAP信号，抑制LCSCs的自我更新能力，减弱其逃逸药物的可能性及新生肿瘤的强耐药性，逆转肝癌的化疗耐药。

5 总结与展望

LncRNA曾被视为无生物学功能的“噪音序列”而被长期忽视，到如今被证实为具有复杂机制的多生物学功能的新分子，参与了蛋白识别、催化、代谢、胚胎干细胞分化[52]、细胞周期调控及肿瘤发生等多种生理或病理过程。虽然越来越多的lncRNAs在肝癌化疗耐药研究中被发现，但其结构及参与肝癌耐药的机制尚未明确。目前的研究多应用体外培养人肝癌细胞株探讨lncRNAs参与肝癌耐药的机制，如H19参与HepG2、Plc/Prf5、Huh7细胞耐药性的相关研究[53]，KCNQ1OT1和FOXD2-AS1参与HepG2、HUH7细胞耐药性的相关研究[54-55]等，但尚缺乏临床研究。随着lncRNAs参与肝癌化疗耐药研究的不断深入及科研水平的提升，lncRNAs将成为攻克肝癌化疗耐药的新方向。