miR-34a-5p及AKT1基因在子宫内膜异位症子宫内膜组织中的表达及其对子宫内膜基质细胞迁移和侵袭的影响

冯婉琴，邓月秀，马颖*

1南方医科大学珠江医院妇产科，广州 510282；2桂林市妇幼保健院妇产科，广西桂林 541001

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)是一种依赖雌激素的慢性良性妇科疾病，能够引起不孕、痛经、盆腔疼痛等症状，在育龄期妇女中发病率较高，且易复发[1-2]。EM是具有种植生长、侵袭、远处转移等类似恶性肿瘤特点的良性疾病，尽管病因学说很多，但其发病机制至今仍然不明确[3]。

微小RNA(miRNA)是一组具有18～25个核苷酸的非编码单链RNA，在调节转录后的基因表达中起着十分重要的作用。miRNA通常表现出与其靶mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)不完全结合，导致mRNA的降解或抑制翻译[4-5]。相关研究阐述了miRNA在多种细胞过程中的关键作用，包括细胞分化、增殖、凋亡、自噬和血管形成[6]。近年来研究发现，恶性肿瘤(如肺癌、肝癌、乳腺癌等)的发生可能与miRNA的失调有关[7-13]。本课题组前期研究发现，miR-34a-5p在EM患者子宫内膜组织中呈低表达[14]， 通过靶基因预测发现miR-34a-5p与丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT1)基因关联密切。本研究旨在分析miR-34a-5p和AKT1在EM患者子宫内膜组织中的表达及其对子宫内膜基质细胞(ESC)迁移及侵袭的 影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2018年1月-2019年6月因子宫肌瘤、子宫腺肌症等良性妇科疾病在南方医科大学珠江医院妇产科行子宫切除术的患者91例，根据术中情况及术后病理结果分为EM组(n=68)与非EM组(n=23)。在无菌操作下将离体子宫迅速剖开并刮取内膜，一部分用甲醛液固定，常温保存用于免疫组化及原位杂交检测，另一部分置于预冷的PBS液中并迅速转运至实验室行原代细胞分离及培养。所有患者均签署知情同意书，本研究经南方医科大学珠江医院伦理委员会批准。

1.2 子宫内膜组织中miR-34a-5p、AKT1基因表达水平检测

1.2.1 原位杂交法检测miR-34a-5p表达水平 将子宫内膜组织石蜡包埋切片(厚4 μm)用4%甲醛固定，经3% H2O2处理后，用蛋白酶K(2 μg/ml)于37 ℃处理30 min，洗涤后37 ℃预杂交2 h。与含地高辛标记的探针杂交、洗涤，接着与碱性磷酸酶偶联的绵羊抗地高辛抗Fab片段孵育1 h。室温下按原位杂交试剂盒说明书操作，并观察分析结果。

1.2.2 免疫组化法检测AKT1表达水平 将子宫内膜组织石蜡包埋切片(厚4 μm)在100%二甲苯中脱蜡，并用乙醇和水进行水化。在100 ℃柠檬酸盐缓冲液中进行热诱导的抗原修复(2 min)。用含有3% H2O2及血清的封闭试剂来封闭特异性抗原，然后在4 ℃下与ANGPT2抗体(美国芝加哥Proteintech公司)1:500孵育过夜。洗涤后，将切片与生物素标记的兔抗山羊抗体和辣根过氧化物酶在室温下孵育15 min。使用3,3-二氨基联苯胺(DAB)显色剂，在DAB缓冲液底物中进行过氧化物酶反应。采用DAB显色并用苏木精复染，中性树胶封闭加盖玻片。使用明视场显微镜对玻片进行分析。

1.3 原代细胞的提取、分离、培养及鉴定 取4%甲醛固定好的子宫内膜组织，PBS漂洗3次，用无菌眼科剪剪碎组织并加入3 ml Ⅰ型胶原酶(1 mg/ml)， 37 ℃消化60 min，每15 min搅拌一次。然后将混合细胞悬液经200目及400目不锈钢细胞滤网过滤，滤液为ESC悬液；接着将筛网反置于另一皿上，用DMEM/F-12培养基反洗筛网回收腺上皮细胞(endometrial epithelial cell，EEC)。将ESC及EEC接种于直径3 cm的培养皿，于37 ℃、5%CO2条件下培养至约60%丰度。加入0.3% Triton-X-100，37 ℃孵育30 min增加细胞膜通透性后置于4%甲醛固定30 min，5%牛血清白蛋白室温封闭20 min，接着加入人波形蛋白和人角蛋白抗体，4 ℃孵育过夜。采用0.3% Triton-X-100及PBS各洗涤2次后分别加入相应二抗，于37 ℃孵育60 min。最后加入100 μl 4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)，孵育15 min后冲洗，甘油封片，共聚焦倒置荧光显微镜观察。

1.4 细胞模型的构建及分组 将ESC培养在含有10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F-12培养基中，收集生长状况良好且处于对数生长期的ESC置于6孔板中进行细胞接种，细胞数量控制在3×105个/孔，使用脂质体-3000将miR-34a-5p mimic及阴性对照RNA(miR-NC)对细胞进行转染，构建miR-34a-5p mimic组及miR-NC组细胞模型，继续置于恒温培养箱中培养24 h。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖率 将miR-34a-5p mimic组及miR-NC组的ESC悬液100 μl分别接种于96孔板(3000～5000个/孔)，于培养箱中培养，12、24、48 h后分别加入CCK-8溶液10 μl，在酶标仪上测定450 nm波长处的光密度(OD)值，并计算两组的细胞增殖率。细胞增殖率=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

1.6 细胞迁移实验 将miR-34a-5p mimic组和miRNC组的ESC细胞接种于6孔板(约5×105个/孔)，培养24 h后待细胞丰度达95%以上时，用枪头在板中垂直划痕后用PBS洗涤3次，加入无血清培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每隔一段时间观察并记录细胞迁移情况。任意选取6～8条水平线，通过Image J软件计算各细胞间的距离。

1.7 细胞侵袭实验 在Transwell小室中加入基质胶，待其聚合形成凝胶后，上室放入无血清培养基重悬的miR-34a-5p mimic组及miR-NC组ESC细胞悬液各200 μl，下室放入600 μl含有10%胎牛血清的培养基，培养24 h后小心取出上室，用线拴住并做好标记，使用中性甲醛固定、1%结晶紫染色后置于显微镜下计算两组穿过基质胶的细胞数。

1.8 细胞凋亡及细胞自噬能力检测 按照细胞凋亡试剂盒(中国康为世纪公司)的操作步骤，首先在miR-34a-5p mimic组及miR-NC组的ESC细胞沉淀中加入缓冲液，然后将细胞悬液转移至5 ml流式管中，避光加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC和10 μl PI，室温下孵育0.5 h后，在流式细胞仪中分析。采用RTPCR法检测miR-34a-5p mimic组及miR-NC组ESC中LC3自噬基因表达水平。收集各组ESC细胞，严格根据试剂盒说明书步骤提取细胞RNA，然后反转录为cDNA，随后进行上机检测，U6及β-actin为内参照，引物序列由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成。

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EM组与非EM组子宫内膜组织中miR-34a-5p、AKT1阳性表达率的比较 miR-34a-5p及AKT1均为胞质染色(图1)。EM组子宫内膜组织中miR-34a-5p阳性表达率低于非EM组(16.2%vs. 82.6%)，而AKT1阳性表达率高于EM组(72.1%vs. 30.4%)，差异均有统计学意义(χ2=34.323、12.581，P＜0.001)。

图1 EM组和非EM组中miR-34a-5p(原位杂交法)和AKT1(免疫组化法)表达情况Fig.1 Expressions of miR-34a-5p (in situ hybridization) and AKT1 (immunohistochemical method) in EM and non-EM group

2.2 ESC的培养与鉴定 培养24 h后，ESC呈梭形或多角形，大概2 d后细胞生长活跃，6～7 d即可铺满培养皿，传代后3～5 d可铺满，10代以内细胞形态基本不变。EEC呈蝌蚪形，培养48 h呈漩涡状，3 d后开始加速生长，呈大细胞集落状生长，5～6 d融合成片状，7 d左右出现脂质空泡，细胞开始崩解。免疫荧光化学染色结果显示，基质细胞为波形蛋白阳性，而上皮细胞为角蛋白阳性(图2)。

2.3 miR-34a-5p mimic组与miR-NC组不同时间点的ESC增殖率比较 miR-34a-5p mimic组培养12、24、48 h后的细胞增殖率(分别为42.25%±7.80%、33.75%±6.70%、24.50%±3.87%)均明显低于miR-NC 组(分别为92.50%±6.76%、80.00%±5.29%、70.25%±4.99%)，差异有统计学意义(t分别为9.735、10.832、14.483，P＜0.001，图3)。

2.4 miR-34a-5p mimic组与miR-NC组ESC的迁移能力比较 miR-34a-5p mimic组的细胞迁移能力(3 0.6 7%±4.0 4%)明显低于m i R-N C 组(65.00%±5.00%)，差异有统计学意义(t=9.25，P＜0.05)。

2.5 miR-34a-5p mimic组与miR-NC组ESC的侵袭能力比较 结晶紫染色检测结果显示，miR-34a-5p mimic组细胞侵袭能力[(32.3±6.1)个]明显低于miR-NC组[(88.0±8.5)个]，差异有统计学意义(t=9.179，P＜0.05，图4)。

图2 子宫内膜基质细胞(ESC)和腺上皮细胞(EEC)免疫荧光双染色(×200)Fig.2 Flurescent images of cytokeratin and vimentin expressed in EEC and ESC (Immunofluorescence double staining, ×200)

图3 miR-34a-5p mimic组与miR-NC组不同时间点的ESC增殖率比较Fig.3 Proliferation rate of ESCs in miR-34a-5p mimic group and miR-NC group

2.6 miR-34a-5p mimic组与miR-NC组ESC的凋亡及自噬能力比较 miR-34a-5p mimic组的细胞凋亡率(18.00%±2.00%)明显高于miR-NC组(9.33%±3.51%)，差异有统计学意义(t=3.714，P=0.021，图5)。miR-34a-5p mimic组的LC3自噬基因表达水平(0.39±0.03)明显高于miR-NC组(0.19±0.04)，差异有统计学意义(t=8.02，P＜0.05)。

3 讨 论

EM的病因众说纷纭，然而其发病机制尚不明确，发病率高且容易复发[15-16]，具有种植生长、侵袭、转移等肿瘤特性，使得学界经常将其发病机制与肿瘤相联系和比较[17]。近年来很多相关研究表明，miRNA在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。李鹏等[18]研究发现，miR-34a-5p在膀胱癌组织

图4 miR-34a-5p mimic组与miR-NC组ESC的侵袭能力比较(结晶紫染色 ×400)Fig.4 Invasion ability of ESCs in miR-34a-5p mimic group and miR-NC group (crystal violet staining, ×400)

中的表达水平降低，miR-34a-5p mimics提高了膀胱癌细胞中miR-34a-5p的表达水平，并且降低膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力。魏丽琼等[19]在研究胃癌的发病机制时发现，miR-34a-5p在胃癌组织中以高表达为主，且miR-34a-5p的高表达与胃癌分化程度、淋巴结转移具有相关性。本课题组前期通过基因芯片测序发现，miR-34a-5p在EM患者中呈现低表达[14]， 本研究通过原位杂交的方法，在组织水平进一步验证了miR-34a-5p在EM患者的子宫内膜组织中阳性表达率较低，由此推测miR-34a-5p对EM的发生发展可能存在一定的负性调控作用。

图5 miR-34a-5p mimic组与miR-NC组ESC的凋亡率比较Fig.5 The apoptosis rate of ESCs in miR-34a-5p mimic group and miR-NC group

miRNA可能是通过某个靶基因来影响疾病的发生发展的[20]。本研究团队早期通过多个靶基因数据库进行miR-34a-5p靶基因的预测，在检索大量文献后，AKT1基因引起了本课题组的关注。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有3个家族成员，分别是AKT1、AKT2和AKT3，其中AKT1与肿瘤的发生发展关系密切[21-23]。石琴琴等[24]研究发现，AKT1在子宫内膜癌组织中呈高表达，抑制AKT1蛋白的表达可影响癌细胞的增殖及凋亡，进而影响子宫内膜癌的发生及发展。章诺贝等[25]研究发现可通过AKT1途径调控胃癌细胞的体外增殖及侵袭力，从而影响胃癌的发生发展。越来越多的研究表明，AKT1与肿瘤密切相关[26]，因而本研究大胆假设AKT1与EM的发生发展也存在一定的关系。本研究从组织水平通过免疫组化的方法检测EM组及非EM组的子宫内膜发现，EM组的AKT1阳性表达率较高，这与AKT1的调控机制相一致。由此更有理由相信AKT1与EM的发病机制存在关联，并推测这种关联是由miR-34a-5p通过靶向AKT1的途径实现的。此外，AKT是一个重要的信号转导中心，有100多个下游靶基因，可影响细胞的代谢、生长、凋亡及增殖等功能。Wu等[27]发现，miR-377-5p可通过靶向AKT1抑制肺癌细胞的增殖、侵袭，调控细胞周期分布。王金燕等[28]探讨淋巴母细胞性淋巴瘤的发病机制时发现，miR-185可通过靶向作用于AKT1基因而抑制Jurkat细胞增殖并促进其凋亡。此外，本研究发现，上调miR-34a-5p表达后，ESC的增殖、侵袭、迁移能力较非EM组明显下降，而凋亡能力及自噬能力明显升高。这些细胞能力都是肿瘤病灶形成、病情发展和癌细胞转移过程中不可或缺的。

综上所述，miR-34a-5p与AKT1基因在子宫内膜组织中的表达水平呈负相关，且miR-34a-5p可能通过靶向AKT1基因来影响ESC的增殖、迁移、侵袭、凋亡及自噬功能，进而影响EM的发病，为临床上治疗EM提供了新的靶点与研究方向。