藜芦甾体生物碱抗肿瘤活性研究进展＊

李文希，张 屏，李福全，张 烜，岳 鑫，包保全＊＊

（1.内蒙古医科大学药学院 呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学基础医学院 呼和浩特 010110；3.呼伦贝尔市蒙医医院 呼伦贝尔 021000）

蒙药“阿格希日嘎”，中文名藜芦，为百合科植物藜芦Veratrum nigrum L.的干燥根及根茎，味苦、辛，性平，有毒，具有泻下、催吐之功效，用于治疗“希拉”病、消化不良、铁垢巴达干，痞症等[1]。本品来源于内蒙古野生藜芦属植物藜芦V.nigrum，主产于呼伦贝尔盟、哲里木盟、赤峰、锡林郭勒盟和乌兰察布盟；其它两种藜芦，毛穗藜芦V.maackii，主产呼伦贝尔盟（鄂伦春自治旗大杨树），兴安藜芦V.dahuricum，主产于大兴安岭（白狼、克一河、宝格达山），也作为蒙药藜芦同等入药[2]。藜芦为蒙医寒热证总泻药，其中泻痞为其主要功效之一。根据蒙医传统理论，现代医学临床诊断的很多肿瘤和癌症都属于蒙医所界定的痞块症。本文对蒙医药古文献中以藜芦为主药的方剂进行了整理，共收集36个方剂，包括剂型、功效主治、组方及出处信息，它们均具有清泻体内邪气和病理产物之功效，其中用于泻痞的方剂有8个。该研究为蒙药藜芦治疗肿瘤及抗肿瘤制剂的开发提供文献依据。

藜芦属（Veratrum）为百合科（Liliaceae）植物，全世界约有四十种，分布于亚洲、欧洲和北美洲，《中国植物志》载有13种1变种，广泛作为药用[3]。本属植物的化学成分包括甾体生物碱类、二苯乙烯类、黄酮类、二肽类及其它，其中甾体生物碱为主要药效活性成分，具有显著的生理效应，例如抗肿瘤、抗病毒、增强心肌收缩力、降血压等[4]。目前，已分离得到甾体生物碱70余种，其结构分类、药理作用及药理毒理研究已有综述报道[5-7]。本文总结了近10年来分离得到的新异甾体生物碱，及在化合物单体层面的抗肿瘤活性研究，包括在细胞水平上的抗肿瘤活性筛选、化合物结构修饰、构效关系及作用机制等，为藜芦及其制剂抗肿瘤药效物质基础研究、质量控制、新药研发提供参考。

1 藜芦（阿格希日嘎）蒙医方剂总结

蒙药藜芦为寒热症总泻药[8]，在蒙医临床中用于泻下、脉泻、鼻泻、导泻和催吐疗法，治疗“希拉”病、消化不良、痞块、铁垢巴达干，剑突痞，痧症，虫症，疫热，胎衣不下，水肿，疮疽等。蒙医理论认为，痞块症系人体某部位，由恶血、黄水等聚集凝结而形成之痞块的总称，多属于继发各种病患的郁结性痼疾，可发生于人体各器官，包括食痞、血痞、赫依性痞块、希拉性痞块、脓痞和水痞等[9]。目前，蒙医临床用于治疗痞块症（包括各种肿瘤和癌症）的药物主要为“破痞去滞”和“泻痞”类蒙药，且临床疗效明显。本文从内蒙古医科大学蒙医药博物馆“蒙医药古文文献全文检索数据库”中收集到以藜芦为主药的蒙药泻下方剂36个，对其剂型、功效主治、组方及出处信息列于表1。其中明确用于泻痞的方剂有8个，列于表格第一部分，包括阿格希日嘎-4（清希拉、泻痞）、肝病缓泻剂（泻肝热、肝硬化）、巴达干泻剂（泻巴达干肿块）、阿格希日嘎-3（泻包如病积聚引起的痞块）、泻痞剂（破痞、泻下）、抑黏红丸（血瘀、痞证）、斑蝥七味丸（脉泻、破痞）、斑蝥九味丸（脉泻、破痞）。表格中还收集了泻“希拉”、清热方剂7个；杀黏、清瘟、泻毒方剂10个，其它泻肝热、“赫依”、包如等10个；催吐方剂1个。这些方剂的整理为蒙药藜芦的泻下应用，尤其是“泻痞”作用提供了依据，极有可能从中找到抗肿瘤活性物质，开发出新型蒙药抗癌制剂。

表1 蒙医药古文文献中藜芦（阿格希日嘎）的方剂总结

续表1

2 藜芦甾体生物碱化学成分研究进展

藜芦属植物中甾体生物碱种类非常丰富，其基本骨架由27个碳组成，甾体部位可分为胆甾烷型和异胆甾烷型两类，胆甾烷型生物碱又可分为茄次碱型（solanidine type）和维藜芦碱型（verazine type），异胆甾烷型又可分为西藜芦碱型（cevine type）和介藜芦胺型（jervine type）[10]，其结构母核见图1。

从藜芦属植物中分离得到的甾体生物碱有70余种[6]，近年又从中分离得到13种新的甾体生物碱。Yue Cong[11]等，2008年从黑藜芦Veratrum nigrum L.中分离得到1种新的生物碱，命名为12-βhydroxylveratroylzygadenine(1)。Veselin Christov[12]等，2010年从黑藜芦Veratrum nigrum L.中分离得到1种新的生物碱，命名为(±)-15-O-(2-Methylbutyroyl)germine(2)。William Jia等[13]，2010年从黑藜芦Vertrum nigrum L.根及根茎分离得到2种新的生物碱，分别命名为neoverapatuline(3)和(1β,3α,5β)-1,3-dihydroxyjervanin-12-en-11-one(4)。Yun Sun等[14]，2012年从大理藜芦Veratrum taliense中分离得到3种新的生物碱，分别命名 为3-O-acetylveralkamine(5)、veralkamine 3-(β-Dglucopyranoside)(6)和6,7-epoxyverdine(8)。汤建等[15]，2008年从兴安藜芦Veratrum dahuricum的根及根茎中分离、鉴定了甾体生物碱26个，包括5种新的甾体生物碱，分别命名为14α-羟基-△11-环杷明(9)、3-乙酰基-15-当归酰基计明碱(10)、3，7-二乙酰基-15-当归酰基计明碱(11)、3-藜芦酰基计明碱(12)、3-藜芦酰基-15-当归酰基计明碱(13)。

3 藜芦甾体生物碱抗癌活性研究进展

图1 藜芦属中甾体生物碱的基本骨架类型

Yun Sun等[13]，2010年从大理藜芦Veratrum taliense中分离得到的8种甾体生物碱，采用MTT法进行体外抗肿瘤活性测定中发现，新化合物3-Oacetylveralkamine（5）对所测试的五种人肿瘤细胞系，即HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7和SW480均有显著的抑制作用，IC50值分别为10.02,17.05,16.51,6.40和5.61μmol·L-1。新 化 合 物veralkamine 3-(β-Dglucopyranoside)（6）和已知化合物藜芦卡明（7）对除SMMC-7721以外的四种肿瘤细胞系有显著抑制作用，IC50值 分 别 为4.07、21.01、13.48、19.04μmol·L-1和10.60、19.08、8.29、11.53μmol·L-1。

Jian Tang等[16-17]，2008-2010年间，从兴安藜芦Veratrum dahuricum根茎中分离得到总生物碱及甾体生物碱类化合物，对其进行体外抗肿瘤活性检测，结果表明藜芦总生物碱对A-549、PANC-1、SW1990和NCI-H249这4种肿瘤细胞系均有一定的抑制活性，并且后续分析表明，介芬胺类生物碱占总生物碱总含量的60-65%，进而推测介芬胺类生物碱很可能是藜芦提取物抗肿瘤活性的活性成分。介芬胺类化合物环杷明（14）对PANC-1、SW1990和NCI-H249三种癌细胞株均有显著的抑制作用，其中对NCI-H249的抑制作用最强(IC50=14.4μmol·L-1）。同时环杷明对肿瘤细胞株A-549、LOVO和QGY-7703也表现出显著的抗肿瘤活性，其IC50值分别为：38.36、40.16、88.36μg·mL-1。藜芦胺（16）显示出与环巴胺类似的细胞毒性，并且对人肿瘤细胞系A549、Aspc-1、PANC-1、SW1990、NCIH249、LOVO、QGY-7703和6T-CEM均表现出显著的抗肿瘤作用，其IC50值分别为8.9、79.6、14.5、26.1、23.23、35.35、15.32μmol·L-1。但介芬胺的葡萄糖苷伪介芬胺（26）和藜芦胺的葡萄糖苷藜芦托素（17），对这四种肿瘤细胞系的IC50值均大于100μg·mL-1；西藜芦碱类化合物中除15-当归酰基计明碱（21）对6T-CEM瘤株有中等抑制作用（IC50=38.74μg·mL-1）外，3,15-二当归酰基计明碱（22）、当归酰基棋盘花胺（23）、藜芦酰基棋盘花胺（24）、计明碱（25）对四种肿瘤细胞系均无显著细胞毒活性。计明碱（25）对SW1990和NCI-H249细胞系比较敏感，其IC50值分别为47.2和24.1μmol·L-1，而对A549和PANC-1细胞系无明显的抑制作用，这是首次发现西藜芦碱类生物碱能够选择性抑Hh信号通路依赖性细胞SW1990和NCI-H249，需要进一步的研究来证实计明碱的抑制活性。

Yue Cong[13]等，2010年从黑藜芦Veratrum nigrum L.的根及根茎中分离得到一种新的生物碱和四种已知生物碱类化合物，其中新的生物碱12β hydroxylveratroylzygadenine（1）和已知生物碱介芬胺（17）、藜芦酰棋盘花碱（30）对人HL-60细胞系均具有显著的抑制效果，其IC50值为52.67、52.90、56.51μmol·L-1。

4 藜芦甾体生物碱构效关系及微生物代谢研究

郭修晗等[18]，2015年以藜芦胺（16）为原料，通过在藜芦胺的哌啶环相应位置引入修饰基团的方法，增加构象限制，设计合成三种藜芦胺类衍生物（18）、（19）、（20）。采用MTT法对所得到的化合物对于人胰腺癌ASPC-1细胞和人胃癌SGC-7901细胞的体外抗肿瘤细胞增殖活性进行评价。相应产物（18）、（19）、（20）具有同对照品环巴胺相似或略强的活性，化合物（18）和（19）对ASPC-1的活性明显优于原料藜芦胺及对照品环巴胺，化合物（19）在对人胰腺癌ASPC-1细胞和人胃癌SGC-7901细胞的IC50分别为18.8μmol·L-1和38.2μmol·L-1。初步构效关系研究结果表明，在藜芦胺的哌啶环上引入烟酸及对硝基苯甲酰基团等修饰基团可显著提高藜芦胺F环的抗肿瘤活性，环巴胺是一种选择性抑制Hedgehog信号通路的甾体生物碱，具有显著的抗肿瘤活性，介芬胺为环巴胺的11氧代衍生物在藜芦中含量较高。两者虽然结构相似，但介芬胺的抗肿瘤活性明显弱于环巴胺[19]。2015年，郑晓红等[19]为研究环巴胺类似物抗肿瘤作用的构效关系，以介芬胺为原料进行结构修饰，采用选择性还原、甲基化及氧化反应合成了环巴胺及8个类似物。运用MS、NMR对产物进行了结构表征，以MTT法研究产物对人胰腺癌ASPC-1和人胃癌SGC-7901细胞体外增殖的抑制作用，结果表明介芬胺的三种还原产物中只有环巴胺显示了良好的抑制活性，而其它两个还原产物的抑制活性与介芬胺类似，说明11位的取代基与化合物的抗肿瘤活性密切相关，当11位为亚甲基时抗肿瘤活性较强，羟基和羰基均降低活性。此外，在氧化产物和甲基化产物中，只有化合物(32)对ASPC-1和SGC-7901两种细胞均具有较好的抑制活性，其IC50分别达到66.68和66.31μmol·L-1，表明3位羟基的氧化可能会增强化合物的抗癌活性。

图2 藜芦属中甾体生物碱的代表性化学结构

Mohammed A.Khanfar[20]对异甾体类生物碱对人转移性前列腺癌PC-3细胞系的增殖和迁移的能力进行研究发现，C-3β-糖苷化（26）以及5α-△5,6（20）还原后对PC-3细胞系的细胞毒性降低。藜芦胺（16）的微生物代谢物（30）在10μmol·L-1浓度下显示出良好的抗增殖活性，表明藜芦醚通过C-3氧化成酮后活性增强，与△5,6迁移至△4,5有关，这种化学修饰可以弥补E环开放造成的活性损失。在伤口愈合测定中发现伪介芬胺和二氢介芬胺的抗迁移活性不好，表明C-3β-糖苷化或△5,6还原会对抗迁移活性产生不利的影响，具有△1,2和△4,5的C-3氧化成酮的藜芦胺微生物代谢产物（31）显示出对前列腺癌PC-3细胞系最有效的抗迁移活性。表明甾体生物碱的药理活性与其母核结构和取代基之间存在着密切的关系。

5 藜芦甾体生物碱的抗癌机制研究

5.1 Hedgehog信号传导途径

现阶段学术界普遍认为，环巴胺在脊椎动物中抗肿瘤作用与Shh基因介导的hedgehog信号通路有关，当该通路过度激活时会影响肿瘤的形成过程[21]。张萍萍[22]等人利用划痕试验表明，环巴胺可显著降低HEC-1A细胞的迁移能力（P＜0.05），同时也反映出环巴胺可削弱人子宫内膜癌HEC-1A细胞的侵袭转移能力。1980年，Hedgehog基因由Nusslein-Vollhard和Wieschaus在研究果蝇的基因突变时发现，Hh信号对肿瘤的形成和生长具有重要作用，细胞特异性的组织增生主要由Hh基因在不同组织中的过度表达和靶基因突变导致，并参与肿瘤的发生和发展[23]。

5.2 Caspase-3依赖性细胞凋亡

丁婧[24]等研究结果表明，环巴胺体外给药能促进AIA软骨细胞的增殖，并抑制AIA软骨细胞的过度凋亡，该抗凋亡作用和提高Bcl-2 mRNA表达，并降低Bax、Caspase-3 mRNA表达密切相关。Caspases（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）是半胱氨酸蛋白酶家族，在启动和执行细胞凋亡（程序性细胞死亡）中发挥重要作用[25]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3是caspase家族的一员，是细胞凋亡的主要下游介质，被认为是caspase的主要执行者[26]。作为各条凋亡通路作用的枢纽、细胞凋亡的执行者的Caspase-3，可使细胞结构的全面解体，而抑制Caspase-3酶活性或拮抗Caspase-3功能可使细胞凋亡受抑制[27]。

5.3 细胞周期

孙全武[28]等研究发现Hedgehog信号通路阻断剂环巴胺对DU145细胞增殖的抑制作用，流式细胞术检测环巴胺对DU145细胞周期的影响发现，环巴胺可以抑制DU145细胞的增殖能力，其机制可能与下调DU145细胞cyclin E mRNA表达水平，从而将DU145细胞阻滞于G1期有关。张萍萍[22]等利用对细胞周期检测结果证实了环巴胺具有可阻滞HEC-1A细胞周期运转，使其停滞于G0∕G1期，从而抑制HEC-1A细胞增殖的作用。人们通过对酵母细胞和哺乳动物细胞的研究发现细胞周期调控系统由两类蛋白家族构成，一类被称为周期素（Cycin），已发现的周期素有CycinA、B、C、D、E等，它们分别作用于细胞周期的不同阶段。另一类称为细胞周期素依赖激酶（cyclindependentkinase，CDK），细胞通过对CDK的正负调控作用来维持自身增殖分裂的平衡，其中P21、P27、P16等能使CDK失活，为其负调节子，而细胞周期素能激活CDK，是CDK的正调节子。

5.4 自噬

李雪等人[22]通过利用流式细胞术及Western blot法进行检测，研究结果显示：HEC-1A细胞经环巴胺处理后，表达LC3B蛋白HEC-1A细胞的百分比明显提高（P＜0.05），同时，细胞中的LC3B蛋白水平也显著上升（P＜0.05），表明了HEC-1A细胞发生自噬可由环巴胺诱导，从而抑制癌细胞生长与存活。作为细胞保存生命活动动态平衡的重要途径的细胞自噬过程，其主要包括细胞内蛋白及细胞器的降解循环。根据已有研究结果证实，肿瘤发生与自噬失调存在明显相关关系，通过利用引发自噬，肿瘤细胞可应对恶劣环境，并维持、调节细胞存活或引发细胞凋亡[29]。

6 结论与展望

藜芦属植物品种多样、分布广泛、多做药用，其中蒙药藜芦泻痞疗效确切，应用历史悠久，为现代抗肿瘤制剂的开发与应用提供参考。中药藜芦与蒙药藜芦在资源分布、功效主治、服用原则与配伍规律等方面有明显差异，前期研究表明两者在化学成分特征图谱上差异显著。特别是具有活性且有毒的甾体生物碱类成分，蒙药藜芦几乎不含有中药藜芦的主要甾体生物碱成分，介芬胺和藜芦胺[30]。近年来，不断从藜芦属植物中分离得到新型的甾体生物碱，该类成分的抗肿瘤活性及作用机制日益得到阐明，其结构修饰的研究也开始起步，为藜芦及其制剂抗肿瘤药效物质基础研究、质量控制、新药研发提供了一定的参考。然而，藜芦甾体生物碱作为抗肿瘤药物的使用也存在一些问题亟待解决。第一，该属植物的介藜芦胺类和西藜芦碱类化合物已被发现具有较好的抗肿瘤活性，但茄次碱型及维藜芦碱型化合物的抗肿瘤活性研究比较少见。第二，甾体生物碱的抗肿瘤作用与其结构密切相关，而到目前为止有关构效关系的研究较少。第三，目前对典型甾体生物碱的作用机制研究较多，很多甾体生物碱的作用机制仍未被阐明，可以结合分子网络药理学来深入研究其活性机制及构效关系。此外，可以结合蒙药方剂学开发出药物新剂型。因此，蒙药藜芦具有极高的研究价值和开发潜力，对其进行更深入的研究和探索，具有广泛而深远的意义。