超声波对樟芝孢子萌发与细胞形态的影响

孙玲　刘利平　王杰　李巧　何荣海　马海乐

摘要 以樟芝菌节孢子为研究对象，通过单因素试验，分析超声介入时间点、超声功率密度、超声频率和超声时长对樟芝菌节孢子发芽率的影响，优化了超声波对樟芝菌节孢子萌发的最佳处理条件：在樟芝菌节孢子接种到培养基中培养9 h后，超声波频率为22 kHz、功率密度为60 W/L处理15 min。采用扫描电镜观察了超声波对节孢子细胞壁的影响，发现超声波处理引起樟芝菌节孢子细胞壁表面形成很多针状物，在一定程度上破坏了细胞壁的结构，随着恢复培养时间的推移，逐渐恢复为表面光滑的细胞壁，这些结果表明可能是由于超声波处理在一定程度上破坏了樟芝节孢子细胞壁的结构，从而促进了樟芝菌节孢子的萌发。

关键词 樟芝菌;节孢子;超声波处理;发芽率;细胞形态

中图分类号 TS201.3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）11-0178-04

Abstract Taking Antrodia camphorara arthrospores as the research object， the effects of ultrasonic intervention time point， ultrasonic power density， ultrasonic frequency and ultrasonic time on the germination rate of Antrodia camphorara arthrospores were analyzed by a single factor test. The optimal treatment conditions for germination of Antrodia camphorara arthrospores by ultrasound were optimized： after arthrospores of Antrodia camphorara cultivated for 9 hours in medium culture， ultrasonic treatment were performed at power density of 60 w/L and frequency of 22 kHz for 15 min. Using scanning electron microscopy （SEM） to observe the effects of the ultrasonic on the cell walls of arthrospores， it was found that the ultrasonic treatment causes the cell walls of arthrospores formed many needles， which destroyed the structure of the cell wall to a certain extent. With the restoration of culture time， it gradually returned to a smooth cell wall. These results suggested that the ultrasonic treatment promoted the germination of arthrospores likely due to the destroyed cell call caused by ultrasonic treatment.

Key words Antrodia camphorate;Arthrospores;Ultrasonic treatment;Germination rate;Cellular morphology

樟芝（Antrodia camphorata），又稱牛樟芝，含有多糖、三萜、倍半萜等多种活性物质，具有抗氧化、消炎、提高免疫力、保肝护肝等功能[1-4]。樟芝属于真菌界、担子菌门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属，专一寄生在台湾特有的常绿阔叶乔木牛樟树腐朽树木上，是一种珍稀的药用真菌。由于野生樟芝的生长非常缓慢，而且樟芝专一寄生的牛樟树资源稀缺，导致野生樟芝子实体的市场价格非常昂贵。液体深层发酵是解决野生樟芝资源紧缺的重要方法，液体深层发酵可在短时间内收集到大量的菌丝体和有效成分[5-6]。樟芝菌丝固体培养和液体培养过程中产生无性孢子——节孢子[7-8]，该孢子可以作为接种物在液体培养时萌发成菌丝，进而互相缠绕形成菌丝球。

优化培养基、施加外界条件可有效提高樟芝菌丝体的发酵产量。其中，超声波已被证实可用于促进多种微生物的生长代谢。超声波是指频率高于20 kHz的声波，具有穿透能力强、方向性、在水中的传播距离远等特点。利用超声波辐射过程中产生的热效应、空化效应和机械剪切效应，有利于提高物质分子的运动速率和频率，从而影响了微生物的生长发育[9-11]、代谢过程[12]、种子萌发[13-14]、品质[15-16]等。为了进一步分析超声波对樟芝菌发酵过程的影响，笔者选择了樟芝菌发酵过程中产生的节孢子为研究对象，分析超声波对樟芝节孢子萌发率及其产量的影响，为超声波辅助樟芝发酵的生产应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。

该研究所用的樟芝菌株是ATCC 200183，从美国菌种保藏中心购买。

1.1.2 试剂。

葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、NaCl和琼脂粉均购自国药化学试剂公司;酵母粉购自北京兰博利德公司商贸公司代理的OXOID品牌。

1.1.3 仪器与设备。

电子天平，塞利多斯公司;灭菌锅，天水华圆医疗器械有限公司;鼓风干燥箱，上海一恒有限公司;超净工作台，苏净台有限公司;生化培养箱，上海一恒公司;摇床，江苏太仓强乐公司;低温离心机，湖南湘仪仪器开发有限公司;磁力加热搅拌器，金坛市城东新瑞仪器厂;pH酸度计，上海雷磁有限公司;HITACHIS-570扫描电子显微镜，美国Agilent公司;倒置荧光显微镜，卡尔·蔡司公司;定频超声波设备，自行研发（图1）。

1.2 方法

1.2.1 樟芝菌株的接种与培养。

1.2.1.1

樟芝菌的试管斜面保存。切下一块5 mm×5 mm的含有樟芝菌的固体培养基，置于PDA斜面上，28 ℃生化培养箱培养，待长满斜面培养基后，加入30%的无菌甘油，封好试管，放入4 ℃的冰箱中，用于菌种保存。

1.2.1.2

樟芝菌的固体培养。切下一块5 mm×5 mm的含有樟芝菌的固体培养基，置于制作好的PDA培养皿中间，盖上培养皿，用封口封好。放入28 ℃的生化培养箱，倒置培养。

1.2.1.3

樟芝菌的液体培养。切下5块5 mm×5 mm的含有樟芝菌的固体培养基，置于装有150 mL PDA的培养基中，8层纱布封口，放入摇床中，28 ℃，150 r/min培养。

1.2.2 樟芝菌节孢子的收集与接种[17-18]。

将含有樟芝菌的培养基接种到PDA培养皿上，在28 ℃的生化培养箱中培养21 d，接着用大约10 mL的无菌生理盐水（0.85%）洗下孢子，经3层无菌擦镜纸过滤到50 mL离心管后，4 ℃，7 000 r/min离心，弃掉上清，用无菌生理盐水（0.85%）悬浮清洗孢子2次，离心后，收集沉淀，再用4～5 mL生理盐水悬浮，用移液枪吸打混匀后取微量于血球计数板计数。剩余孢子用于培养。

根据血球计数板计数孢子浓度，按接种后孢子浓度为1×106 spores/mL的接种量分别接到3个装有50 mL发酵基础培养液（葡萄糖20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，pH=4.5）的摇瓶中，作为3个生物重复。

孢子接种量（spores/mL）=孢子数（spores）/接种后的培养基体积（mL）。

1.2.3 超声处理樟芝菌的节孢子。

在定频超声波槽中加入5 L水，将定频超声的总超声时间分别调为每个周期超声时间10 s，间隔时间为15 s，分别设定超声介入时间点、超声功率密度、超声时长和不同的单因素做超声条件的优化：

①当单因素为超声介入时间点时，设置刚接入节孢子0、3、6、9 h后用频率為22 kHz、功率为60 W/L的超声波处理15 min;

②当单因素为超声功率密度时，分别设置超声功率密度为30、60、90、120和150 W/L，在孢子接入培养液中9 h后，用频率为22 kHz的超声波处理15 min;

③当单因素为超声时长时，分别设置超声时间为15、30、45、60和75 min，在孢子接入培养液中9 h后，用频率为22 kHz且功率密度为60 W/L的超声波处理;

④当单因素为超声频率时，分别设置超声频率为22、28、33、40、68 kHz，在孢子接入培养液中9 h后，用功率密度为60 W/L的超声波处理15 min。

1.2.4 樟芝节孢子萌发率的统计。

接种孢子正常培养8、16、24、32、40、48 h后，取样，用普通光学显微镜观察孢子生长情况，以孢子长度超过原来的2倍视为孢子萌发[25]，统计各个时间点的孢子萌发率，绘制孢子萌发变化趋势图;对于超声波单因素试验，在接种孢子正常培养19 h时统计孢子萌发率。吸取每一瓶中的樟芝节孢子培养液置于血球计数板上，统计50个节孢子的萌发率，重复取3次，计算每一个生物重复的节孢子的萌发率均值，采用同样的方法计算3个生物重复的节孢子萌发率，采用标准误差（SE）用于生物学统计分析超声处理对节孢子萌发率提高率的影响。

1.2.5 扫描电镜观察樟芝菌节孢子。

从樟芝菌平板上收集较多的节孢子接种到发酵基础培养液中，利用频率为22 kHz、功率密度为60 W/L的超声波处理15 min后，收集樟芝孢子先用PBS缓冲液清洗3次，2.5%戊二醛溶液在4 ℃冰箱中固定4 h，再用PBS缓冲液清洗3次，先后采用含有30%、50%、70%、85%、90%体积浓度的无水乙醇梯度脱水各1次，每次15 min;再用100%乙醇脱水2次，每次15 min，乙酸异戊酯清洗2次，每次浸泡15 min，5 000 r/min离心5 min，最后冷冻干燥。将冷冻干燥后的样品粘附于干净的铝箔片上，置于样品舱中进行喷金。样品取出后，置于HITACHIS-570扫描电子显微镜观察室中进行观察。

2 结果与分析

2.1 樟芝孢子发芽率的变化趋势

从试管中保藏的樟芝菌斜面上切取5 mm×5 mm转移新鲜配制的PDA培养基上，28 ℃培养箱中培养3 d后慢慢生长出黄色的菌丝，7 d后菌丝体逐渐变厚，颜色变深，当培养30 d后，樟芝菌丝基本铺满培养皿（图2a）。待菌丝生长30 d后，通过刮取固体培养基上的菌丝，过滤收集樟芝节孢子如图2b所示。通过将分离出的樟芝菌节孢子接种到孢子萌发培养基中，统计分析了孢子萌发率，如图3所示，樟芝菌节孢子在接种后的第16小时，节孢子开始萌发，其萌发率为14.1%;24 h时，节孢子萌发率为68.7%;32 h时，节孢子萌发率为75.5%;48 h时，节孢子萌发率为100%。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声波处理介入时间点对樟芝菌节孢子萌发率的影响。

为了分析在接种后的不同时间介入超声处理对樟芝菌节孢子发芽率增长率的影响，用频率为22 kHz、功率密度为60 W/L的超声波对节孢子处理15 min，如图4所示，与未处理的对照相比，当节孢子接种到培养基后（0 h）立即超声波处理，节孢子萌发率提高了14.8%;当节孢子接种后培养3 h再超声波处理，节孢子萌发率没有提高;当节孢子接种后培养6 h再超声波处理，节孢子萌发率提高了22.0%;当樟芝菌节孢子接种后培养9 h再超声波处理，节孢子萌发率提高了59.7%，可见在当樟芝菌节孢子接种到孢子萌发培养基后培养9 h为最佳的超声波介入处理时间点。

2.2.2 超声功率密度对樟芝菌节孢子萌发率的影响。

为了分析超声功率密度对樟芝菌节孢子发芽率的影响，用频率为22 kHz的超声波对刚接种到孢子萌发培养基后的樟芝菌节孢子（0 h）超声处理15 min，如图5所示，与未处理的对照相比，超声功率密度为60 W/L时，超声处理后的樟芝菌节孢子发芽率提高了39.3%;当超声功率密度为120 W/L时，发芽率提高了32.5%;当超声功率密度为150 W/L时，发芽率提高了26.2%;当超声功率密度为30和90 W/L时，发芽率提高不明显。因此，60 W/L为最佳超声功率密度。

2.2.3 超声时长对樟芝菌节孢子萌发率的影响。

为了分析超声时长对樟芝菌节孢子发芽率的影响，用频率为22 kHz、功率密度为60 W/L的超声波对刚接种到孢子萌发培养基后的樟芝菌节孢子（0 h）超声处理不同时间，如图6所示，与未处理的对照相比，超声时长为15 min时，樟芝菌节孢子发芽率提高了36.4%;超声时长为75 min时，节孢子发芽率提高了10.8%;当超声处理时间为30、45和60 min时，节孢子发芽率提高不明显甚至降低了。因此，15 min为最佳的超声处理时间。

2.2.4 超声频率对樟芝菌节孢子萌发率的影响。

為了分析超声频率对樟芝菌节孢子发芽率的影响，用不同频率但功率密度为60 W/L的超声波对刚接种到孢子萌发培养基后的樟芝菌节孢子（0 h）超声处理15 min，如图7所示，与未处理的对照相比，超声频率为22 kHz时，超声处理后的樟芝菌节孢子发芽率提高了23.3%;超声频率为28和68 kHz时，超声处理对节孢子发芽率影响较小;但当超声频率为33和40 kHz时，超声处理对樟芝菌节孢子发芽率有降低作用。因此，22 kHz为最佳的超声处理频率。

2.3 扫描电镜分析超声处理对樟芝菌节孢子细胞形态的影响

为了进一步分析超声波对樟芝菌节孢子发芽的影响，利用扫描电镜观察分析优化后的超声波处理对樟芝菌节孢子细胞形态的影响。如图8所示，未施加超声波处理的对照组的节孢子表面光滑，细胞壁纹理清晰，当超声波处理后，节孢子细胞壁表面不光滑，有很多针状物，在节孢子的两端周边有裂痕;当超声处理后恢复培养4 h（图9），节孢子细胞壁表面的针状物消失，表面只残留一些碎片状的残留物;当超声波处理后恢复培养12 h（图9），处理组的节孢子细胞壁与对照组细胞壁相似，细胞壁表面光滑，但处理组中部分节孢子长度伸长、细胞壁明显破裂，节孢子开始萌发。由此可见，超声波处理引起樟芝菌节孢子细胞壁表面形成很多针状物，在一定程度上破坏了细胞壁的结构，随着恢复培养时间的推移，逐渐恢复为表面光滑的细胞壁，推测正是由于超声波对细胞壁结构的破坏促进了樟芝菌节孢子的萌发。

3 结论

该研究通过单因素试验优化了超声波对樟芝菌节孢子萌发的最佳处理条件：在樟芝菌节孢子接种到培养基中培养9 h后，超声波频率为22 kHz、功率密度为60 W/L处理15 min。通过扫描电镜分析发现，超声波处理引起樟芝菌节孢子细胞壁表面形成很多针状物，随着恢复培养时间的推移，逐渐恢复为表面光滑的细胞壁;超声波处理节孢子对发酵前期和高峰期的菌丝球产量影响较小，但超声波处理明显有利于保持樟芝菌产量的降低，有利于保持更长时间的发酵生长活力，可能有利于更多代谢物的产生。

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