去细胞化全肝脏生物支架的制备及初步分析

张庆峰，梁志培，李建国，张贵臣，刘军利，杨士柏

(山东医学高等专科学校附属医院，山东 临沂 276000)

目前，在我国治疗肝脏终末期疾病唯一有效的方法就是肝脏移植，但受经济与供体来源短缺的限制，只有部分患者可以接受到此种疗法。为此，积极寻找可以有效替代肝脏功能的产品是临床所面临的问题。本文对去细胞化肝脏生物支架(Decellularized liver biological scaffold，DLBS)的制备进行了初步的分析与研究。

1 资料与方法

1.1动物及试剂 试验动物为30只SD大鼠，体质量250～300 g，雌雄各15只，均由临沂大学实验动物中心提供。对大鼠进行等条件喂养，且对其处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则。1%曲拉通X-100(Triton X-100)与胰酶-乙二胺四乙酸均由美国signla公司生产与提供，胎牛血清由杭州四季青生物试剂公司生产，DMEM低糖培养基由美国GIBCO公司生产，表皮生长因子及肝细胞生长因子由美国Peprotech公司提供。

1.2方法

1.2.1DLBS的制备 对大鼠应用0.44 ml、3.6%水合氯醛实施腹腔注射麻醉与开腹，通过门静脉插管灌注500 ml、0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，5 L、1%Triton X-100，2 L胰酶、0.2 g/L的EDTA，最后利用20LPBS对残留的Triton X-100进行冲洗，灌注速度要控制在10 ml/min，时间共36 h。将灌注完毕的DLBS储存在4℃的PBS液中。

1.2.2DLBS的生物学特征鉴定 随机对DLBS进行多部位的取材，并实施固定、脱水与石蜡包埋，对石蜡实施切片、脱蜡与HE染色。对其胶原纤维的完整性与无细胞核的残存情况进行观察。取1.0 cm×0.8 cm大小的DLBS标本，用2.5%戊二醛进行固定，将其保存在4℃的环境下，应用扫描电镜进行观察。

1.2.3DLBS的细胞相容性鉴定 在-20℃条件下，对DLBS实施冰冻切片(厚度1 mm)，将切片悬浮在6孔培养板内，采用Y射线进行照射消毒，将其漂洗浸泡在PBS与DMEM低糖培养基中，持续l d后，选择优质一代C3A、SD大鼠骨髓间充质干细胞，依据1×105/ml密度[1]，将其接种在贴有支架切片的6孔培养板内进行培养。

1.2.4DLBS对C3A细胞增殖的影响 按照5 ml/cm2，将DLBS放入适量的DMEM培养液(含10%FBS)，将其静置在37℃的条件下，持续24 h，制备浸提液，并将其浓度稀释到50%。将C3A细胞稀释成l×104个细胞/ml，接种在3块96孔板上，每板3组，每组5孔，每孔150μl，将其置入5%CO2、37℃的培养箱中，培养24 h，将原培养液弃掉。参照组(A)添加10%FBS的DMEM 100 μl，研究组分别添加50%(B)与100%(C)的样品浸出液，将其保存在培养箱中，最后分别在3、6、9 d各拿出l块培养样板，每孔添加5 mg/ml的MTT 20μl，连续培养4 h，将培养液倒出，加入100μl二甲基亚砜，振荡10 min，用酶联免疫检测仪进行吸收值测试，波长为490 nm。细胞相对增值率(RGR)=实验组吸光值/对照组吸光值。

1.2.5DLBS组织相容性评价 剪切一块DLBS组织，将其埋植在另一只SD大鼠背部皮下，埋植2周后将DLBS组织块取出，实施石蜡包埋切片，利用行H-E染色对其体内炎症反应与DLBS的免疫源性进行评价。

2 结果

2.1DLBS的制作 30只SD大鼠中，成功28只，失败2只，成功率为93.33%。由此可知，化学去垢剂和酶联合制备DLBS成功率较高。

2.2DLBS的组织学观察 肝脏生物支架包膜完整，外观透明，肝脏形态完整，包膜内Glisson系统保存良好，无细胞核残留，细胞外基质样结构良好(见封三图1)。肝脏内无细胞成分与溶解、断裂情况，且胶原纤维排列整齐(见封三图2)。

2.3DLBS细胞相容性鉴定 SD大鼠骨髓间充质干细胞密集、黏附在DLBS上，生长情况良好；细胞在DLBS上的生长情况良好，说明DLBS的细胞相容性较好。

2.4DLBS对C3A细胞增殖的影响 B、C组的RGR>1。3组各时间吸光值比较均有统计学意义，两两比较显示：均以C组最高，B组次之，A组最低(q=3.64～29.46；P<0.05)，见表1。

表1 外细胞毒性实验结果

2.5皮下包埋实验 组织内出现炎症细胞浸润情况较少(见封三图3)，由此可知，该制备技术去细胞效果明显，且无免疫与炎症反应。

3 讨论

近年来，随着我国医疗技术水平的不断提高，肝脏组织工程的发展为终末期肝病的治疗提供了新的选择与治疗途径。研究发现，天然细胞外基质成分在细胞的发育、分化、迁移、粘附、增殖、三维空间排列方式等多个方面起到了十分重要的作用。目前，肝脏组织工程面临的最大的问题与挑战就是如何有效解决肝细胞组织化培养过程中所需要的氧气和营养供应等。传统的合成材料制作过程虽然相对简单，但却无法有效满足肝细胞生长所必须的条件[2-4]。去细胞化支架材料的整体结构与人体内的生长环境十分相似，从而更利于肝细胞的生长。另外，多项研究表明，去细胞化生物支架材料保留了大量的细胞活性成分，有明显的促进细胞生长的功能[5-7]。本研究利用化学去垢剂-酶联合去细胞技术制成的全肝脏生物支架，支架上无细胞成分的残余，却完整地保留了血管、胆管等结构，使利用这些管道为细胞提供营养成为可能。

总之，采用化学去垢剂-酶与去细胞化技术制备去细胞化全肝脏生物支架具有较为突出的优势，不仅有效保留支架结构的完整性，具备良好的细胞与组织相容性，同时也能大大减少异体组织的免疫反应，促进其生长，实用性较高。